химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

фракционный анализ

Получение производных с тяжелыми атомами

Установление структуры с разрешением 3-4 А

Предсказание локализации мутаций

Анализ свойств мутантного белка

Дифференциальный Фурье-анализ мутантного белка

Установление структуры с разрешением 2-2,5 А

РИС. 2.

ние поставить простой, но элегантный эксперимент с целью решить конкретную проблему, а автоматические анализаторы, секвенаторы и масс-спектрометры, хотя и являются необходимым атрибутом его деятельности, по существу играют роль всего лишь средства для решения научных задач.

В конце концов появление этой книги должно вызвать одобрение специалистов, так как наряду с неизбежным изобилием подробных «рецептов» в нее включены дельные советы. Но главную ценность книга, по-видимому, будет иметь для биохимика широкого профиля, перед которым вдруг возникает необходимость поработать в белковой химии, а для этого ему надо иметь единственный Вадемекум*, которого до настоящего времени не было. Теперь он его имеет.

Директор Центра биотехнологии,

Королевский колледж науки и технологии, Лондон

_ 5. С. Хартли

* Вадемекум — от лат. Vade mecum, что значит «иди за мной». Это принятое название справочников и путеводителей, в особенности малого формата. — Прим. перев.

НЕКОТОРЫЕ СОКРАЩЕНИЯ И ОБОЗНАЧЕНИЯ, ПРИНЯТЫЕ В КНИГЕ

АПС-

р-апс-атз-

бж)хб-бса-бти-

бувп-

вэжх-

вэтт-

гжх-

гф

гфмк-

дабитц-дабтг-дгпаэ-дитц-дмаа-дмба-дмсо-дмфа-

днс-

днф-дох-дсн-дтнб-

ДТТ-

дцк-

дфф~ дэаэ-ед. опт. плотн.-жф-

ио-вэжх-

квадрол —

аминопропилстекло

p-N-амииоэтил- (3-аминопропил) стекло 2-аиилино-5-тиазолиноп быстрая жидкостная хроматография белков бычий сывороточный альбумин бис- (1,1-трифтороацетокси)иодобензол бутанол — уксусная кислота — вода — пиридин высокоэффективная жидкостная хроматография

высота, эквивалентная теоретической тарелке газожидкостная хроматография газофазный

гептафторомасляная кислота 4-диметиламипоазобензол-4/г-изотиоцианат

4- диметиламииоазобензол-4/-тиогидантоин 2- (гидроксипропил) аминоэтил /2-фепилендиизотиоциапат диметилаллиламин диметил бензил амин димстилсульфоксид диметилформамид

5- диметиламииопафталип-1-сульфонил дииитрофепил дсзоксихолат натрия додецилсульфат натрия

5,5/-дитиобис(2-нитробензойная кислота) — реагент Эллмана дитиотреит

дициклогексилкарбодиимид диизопропилфторофосфат диэтиламииоэтил единицы оптической плотности жидкофазный

ионообменная высокоэффективная жидкостная хроматография

N,'N,N',N'-TeTpaKHc- (2-гидроксипропил)эти-лендиамин

HEKOlOPUh СОКРАЩЕНИЯ И ObO. 1 AMЕ1II ПРППЯ1ЫЕ В КНИГЕ

км-митц-

нбф-

нмм-нтб-нтсб-нтцб-нэм-офа-

оф-вэжх-

пааг-пмк-полибрен-

пфб-Вг-

сп-

тгф-темед-тма-тнбс-тнф-трис-тф~ тфк-

тфу-тэа-тэта-фитц-фмсф-фтг-фтк"

ф-эдк-

-карооксиметил

- метилизотиоцианат -4-хлоро-7-питробензофуран

- N-метилморфолип

- 2-11итро-5-тнобензоат

- 2-ш1тро-5-тносульфобензоат

- 2-иитро-5-тиоциапобепзоат

- N-этилморфолин

- о-фталевый альдегид

-обращешю-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография

- полиакриламидный гель

- пиромеллитовая кислота

- 1,5-диметил-1,5-диазаупдекаметиленполиме-тобромид

- 2-бромо-2,3,4,5,6-пентафторотолуол -сульфопропил

- тетрагидрофуран

- тетраметилендиамип

- триметиламии

- 2,4,6-триинтробензолсульфокислота

- 2,4,6-тринитрофснил

- трис- (гидроксиметил) аминомегап

- твердофазный

-L- (1-тозил а мидо-2-фенил) этил хлорометил кетой

- грифтороуксусная кислота

- триэтиламин триэтилептетрамип

- фенилизопюциапат

- фенил метил сульфопил фторид

- фепилтиогндантоип

-феиилтиокарбамоил

- фосфо

- 1-этил-З- (3-диметиламннопропил) карбодп-имид

ВОС — гргт-бутилоксикарбопил BNPS-скатол — 2- (2-ни грофенилсульфепил) З-метил-З-бромо-

ппдолепип

CPG — стекло с контролируемым размером пор HNBBr— 2-гидрокси-5-иитробензилбромид HOBt— 1-гидроксибеизотриазол HOSu— 1-гидроксисукципимид NBS — N-бромосукцинимид

Глава 1

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОСТАВА БЕЛКОВЫХ ОЛИГОМЕРОВ. ПОЛУЧЕНИЕ МОНОМЕРОВ И ПОЛИПЕПТИДНЫХ

ЦЕПЕЙ

Р. К. МАРШЕЛЛ, А. С. ИНГЛИС (R. С. MARSHALL, A. S. 1NGLIS, Division of Protein Chemistry, CSIRO, 343 Royat Parade, Parkville, 3052 Victoria, Australia)

1.1. Введение

В настоящей г.тане главным образом обсуждаются применяемые на практике методы определения состава белковых олигомеров, способы идентификации и разделения мономеров, а также методы выделения отдельных полипептидиых цепей. Как известно, молекула олигомериого белка построена из пековалентио связанных мономеров (субъедипиц), которые в свою очередь могут включать несколько полипептидиых цепей, соединенных дисуль-фидиыми мостиками (или другим типом ковалентной связи). Например, тетрамер, составленный из двух пар различных мономеров, один из которых содержит две полппептидные цепи, можно схематически представить следующим образом:

-s-s-fg:

диссоциация _ _

-> 2©+ 2\Ц-$$-Ш

олигомер мономеры

б o-ss-^B0C-^^.Me C3SH + hs-O

сшитый мономер полипептидные

цепи

Описанные в главе методы могут быть использованы для оценки стсхиометрического состава олигомеров. В свою очередь данные об относительном количестве мономеров в олигомере, их молекулярной массе и свойствах дают полезную предварительную информацию о третичной и четвертичной структурах олигомера. Однако рассмотрение закономерностей (и симметрии) структурной организации сложных олигомеров не входит в задачу данной главы Г131]. Дополнительную информацию читатель может найти в специальных обзорах, посвященных четвертичной структуре белков [93], белок-белковым взаимодействиям [62], методам определения субъединичной структуры [173].

Поскольку методы идентификации мономеров и отдельных фрагментов олигомеров входят как составная часть в структур-

16

1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОСТАВА БЕЛКОВЫХ ОЛИГОМЕРОВ

ный анализ олигомеров, вполне возможно, что излагаемый здесь материал может частично дублироваться в других главах. Описанные в главе методы эксперимента рекомендованы читателю на основании личного опыта авторов и их коллег с учетом того, что для их осуществления требуются небольшие материальные затраты, а также того, что методики хорошо воспроизводятся. Сложным в техническом отношении методам, таким, например, как масс-спектрометрия, ультрацеитрифугирование и рентгепо-структурный анализ, посвящены гл. 19 и 20. Дополнительную информацию можно найти также в специальных обзорах [4, 88, 93, 177].

Методы выделения и идентификации мономеров дают информацию о молекулярной массе олигомера и его субъединиц, их количестве и свойствах, позволяют получать препараты для определения первичной структуры. Если удается получить белок в виде кристаллов, изучение первичной структуры удобно вести параллельно с помощью секвенировапия и физических методов (например, рентгеноструктурного анализа), поскольку сопоставление получаемой информации существенно ускоряет ход анализа [158]. Однако такая возможность представляется редко. Часто именно получение достаточно чистых препаратов белка или субъединиц, пригодных для проведения аминокислотного анализа, и составляет одну из главных проблем, поскольку исследуемый белок может присутствовать лишь в незначительных количествах в сложной смеси сопутствующих белков и продуктов их деградации или же исходная смесь может содержать белки с очень близкими свойствами. Если белок плохо растворим и требует более жестких условий для солюбилизации, гетерогенные препараты могут быть получены уже на начальном этапе выделения. Причиной появления гетерогенности может быть, по-видимому, изменение суммарного заряда из-за дезами-дировапия амидных групп аспарагина и глутамина, карбами-лирование е-аминогрупп некоторых остатков лизина ионом цианата, присутствующим в растворах мочевины [38], неспецифическая модификация остатков метионина и гистидина при алкилировании цистеина.

Причиной гетерогенности по молекулярной массе может быть расщепление лабильных пептидных связей, например неустойчивой в кислой среде, в частности в 80%-ной муравьиной кислоте, связи Asp-Pro [100]. Признаком такого гидролиза можег послужить обнаружение N-концевого остатка пролина. Важным условием получения гомогенного белка является отсутствие в препарате примесей протеаз, поскольку в следовых количествах они вызывают ограниченный протеолиз по отдельным пептидным связям [91].

Относительно легко может осуществляться блокирование

1.2. МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ ОЛИГОМЕРОВ

17

а-аминогруппы N-концевого аминокислотного остатка, что делает невозможным секвенирование. Наиболее частыми причинами такой блокировки являются циклизация N-концевого остатка глутамина, карбамилирование ос-аминогрупп в растворах мочевины, а также присутствие в реагентах следов альдегидов [54].

Указанных осложнений можно избежать, если тщательна соблюдать условия проведения реакций и придерживаться рекомендованных методик проведения экспериментов.

1.2. Методы идентификации олигомеров

Молекулярную массу интактного олигомера определяют в не-денатурирующих условиях с помощью методов ультрацентрифугирования, гель-фильтрации и электрофореза в градиенте иолиакриламидного геля (ПААГ). Устойчивость и растворимость большинства олигомерных белков зависит от ионной силы и рН буферного раствора. В отличие от электрофореза в ПААГ> где на состав буферных растворов накладываются определенные ограничения, в частности ионная сила не должна превышать 0,1, гель-фильтрацию можно вести в буферных растворах, стабилизирующих олигомер (например, в присутствии ионов металлов или кофакторов). Для определения молекулярной массы белков применяют классический вариант гель-фильтрации на сшитых декстранах, полиакриламиде или агарозе. В последнее время получены гели нового типа, позволяющие вести процесс при повышенном давлении, благодаря чему время анализа сокращается с 1—2 сут до 30 мин (гл. 6).

1.2.1. Электрофорез в градиенте ПААГ [5, 98, 112, 113]

Сущность метода состоит в том, что под действием электрического поля белковые зоны мигрируют в полиакриламидном геле с уменьшающимися размерами пор до некоторого конечного положения, обусловленного сопротивлением среды. Таким образом, расстояние, пройденное зоной белка, связано с молекулярной массой, которую можно определить путем сравнения с поведением белков-маркеров.

Хотя белки с небольшим суммарным зарядом имеют низкую электрофоретическую подвижность, конечное положение зон практически не зависит от величины заряда при условии, что все исследуемые белки имеют заряд одного знака, а рН буфера заметно отличается от их изоэлектрических точек.

2—701

18

1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОСТАВА БЕЛКОВЫХ ОЛИГОМЕРОВ

1.2.LL Описание метода. Известно множество вариантов прибора для электрофореза в вертикальных или горизонтальных пластинах (блоках) полиакриламидного геля [24, 73, 142, 170]. Источник питания должен обеспечивать стабилизацию по напряжению и по току, наличие термостата в таких приборах необязательно.

В качестве пористой среды используются в основном поли-акриламидные гели, полностью заменившие ранее применявшийся крахмал. Гель различной пористости (градиентный гель) готовят, варьируя соотношение и концентрацию мономеров — акриламида CH2~CHCONH2 и бифункционального N,N'-MeTH-лепбисакриламида CH2=CHCONHCH2NHCOCH = CH2, выполняющего функцию сшивающего агента (разд. 1.3.1.1). Следует помнить, что акриламид — нейротоксичный яд. Некоторые исследователи полагают, что наилучшие результаты можно получить только при использовании мономеров, дополнительно очищенных путем перекристаллизации [35]. Однако вполне удовлетворительные результаты получаются при применении обычных коммерческих реактивов. Остальные реагенты должны иметь квалификацию «ч. д. а.».

Линейный градиент концентрации создают с помощью двух сообщающихся сосудов цилиндрической формы и перистальтического насоса или же с помощью градиентного смесителя иного, более сложного типа [113]. При недостатке опыта готовить градиентные гели высокого качества и с хорошей воспроизводимостью бывает затруднительно, в таких случаях можно воспользоваться готовыми пластинами (фирмы Gradipore, LKB, Pharmacia).

Белки с молярной массой 13 000—100 000 фракционируют в гелях с градиентом концентрации 4—30%, для белков с молярной массой 200 000—1 000 000 используют гель с градиентом 4—-16%. Гель вначале уравновешивают рабочим буферным раствором. Для этого проводят предварительный электрофорез при 150 В в течение 1 ч.

Проведение электрофореза. Для приготовления запасного электродного буфера (трис — ЭДТА — борная кислота) растворяют в дистиллированной воде 121 г триса, 15,6 г ЭДТА (ди-натриевой соли) и 9,2 г борной кислоты, объем раствора доводят до 1 л. Перед употреблением запасной раствор разбавляют дистиллированной водой (1 :10).

Образец белка растворяют или диализируют против разбавленного электродного буфера, содержащего бромофеноловый синий (0,1% масс/об.) и глицерин (10% масс/об.). В лунки с помощью микропипетки или микрошприца вносят 2—5 мкл раствора образца (с концентрацией 0,5 мкг/мкл). Электрофорез проводят при 150 В в течение 7—16 ч. Гель калибруют с по-

1.2. МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ ОЛИГОМЕРОВ

19

мощью белков-маркеров [93]. Наборы стандартных белков, поставляемых фирмой Pharmacia, представляют собой лиофильно высушенную смесь тироглобулина (М 669 000), ферритина (М 440 000), каталазы (М 232 000), лактатдегидрогеназы (М 140 000) и альбумина (М 67000).

Окрашивание красителем кумасси ярко-голубой. По завершении электрофореза белковые зоны локализуют путем окрашивания красителем кумасси ярко-голубой, обозначаемый в литературе как CBBG250. Для окрашивания гелей используют 0,15%-ный (масс/об.) раствор СВВ G 250 в смеси метанол.— ледяная уксусная кислота— вода (50: 10:40). Для приготовления раствора красителя его вначале растворяют в метаноле, затем добавляют уксусную кислоту и воду, после чего раствор фильтруют. Для обесцвечивания геля, пластину выдерживают в течение 12 ч в смеси метанол — ледяная уксусная кислота — вода (5:7,5:87,5).

Обработку геля ведут в фотографической кювете, накрытой крышкой с целью уменьшить испарение метанола. Время от времени (примерно каждый час) кювету покачивают. Раствор красителя (его можно использовать до 20 раз) сливают в склянку с притертой пробкой и в кювету заливают раствор для обесцвечивания. Если раствор для отмывки не содержит поглощающих краситель материалов (отрезок шерстяной ткани размером 100x100 мм, губчатая резина, гранулы ионита), то раствор заменяют на свежий 2—3 раза в течение 24 ч. Хранят гель в 10%-ной уксусной кислоте. Разработан электрофоретический способ отмывки красителя, однако иногда такая отмывка сопровождается обесцвечиванием белковых зон.

Окрашивание растворами солей серебра. Наиболее чувствительный метод обнаружения белковых зон заключается в пропитывании геля раствором нитрата серебра; затем гель обрабатывают восстановителем и раствором соды. При этом комплексы полипептид — серебро обнаруживаются в виде черных полос. Проявления солями серебра можно проводить после окрашивания красителем кумасси, который предварительно отмывают смесью метанол — уксусная кислота [138]. Наборы реактивов дл

страница 2
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
футбольная форма на заказ с нанесением имени и номера в челябинске
монтаж акустических панелей цена
купить обеденный стол в интернет магазине
перевертыши подномерники купить

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(05.12.2016)