химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

вухступенчатая реакция цианирования идет при взаимодействии цианидов со смешанными дисульфидами, образующимися при реакции между ци-стеинсодержащим белком и 2-нитрофенилсульфепилхлоридом в водной уксусной кислоте [46, 48, 49].

Избирательное расщепление по. остаткам тноцианоаланииа проводят в щелочной среде (рН 9) при 37°С в течение 24 ч. В этих условиях остатки тиоцианоалапипа подвергаются ?-эли-минированию с образованием тиоцианата и дегидроалапина (разд. 2.5.2). Поскольку реакции расщепления и р-элимиииро-вания проходят в слабощелочной среде одновременно, следовало ожидать, что они будут конкурировать и расщепление пептидной связи пройдет с низким выходом. Однако результаты, полученные при анализе ряда белков, свидетельствуют о том, что расщепление идет почти количественно [183]. Низкий выход, вероятно, объясняется неполнотой цианирования. На примере папаина [105], каталитической субъедипицы аспартат-транскарбамилазы Е. coll [194] и изоцитратдегидро-геназы Azotobacter vinelandii [28] было установлено, что мопо-тиоцианопроизводные нативного белка не циклизуются, а расщепление пептидных связей происходит только после денатурации [194]. Следовательно, стадию расщепления S-цианирован-ного белка следует проводить в присутствии денатурирующих агентов, например гуапидин-НС1.

2.7.1. Цианирование с помощью 2-нитро-5-тиоциано6ензойной кислоты [96]

Образец белка растворяют в 0,2 М трис-ацетатном буфере (рН 8), содержащем 6 М гуанидин-HCl. Если белок не содержит S—S-групп, в буфер добавляют небольшой избыток дити-

2.7. РАСЩЕПЛЕНИЕ ПО ЦИСТЕИНУ

121

отреита и инкубируют при 20 °С в течение 30 мин. С целью восстановления S—S-групп создают 10 мМ концентрацию дитиотреита и инкубируют при 37 °С в течение 1—2 ч. Затем прибавляют 2-нитро-5-тиоцианобензойную кислоту (5-кратный молярный избыток в расчете на SH-группу), в случае необходимости рН поддерживают с помощью NaOH и инкубируют при 37°С в течение 15 мин. Подкисляют реакционную смесь до рН^4, охлаждают до 4°С и отделяют низкомолекулярные компоненты диализом или гель-фильтрацией в 50%-ной уксусной кислоте или в другом летучем буфере с низким рН. Образец можно хранить в 50%-ной уксусной кислоте при —20°С. Для проведения реакции расщепления образец тщательно высушивают, вновь растворяют в 0,1 М Na-боратном буфере (рН 9,0), содержащем 6 М гуанидин-HCl, и инкубируют при 37°С в течение 12—16 ч.

Широкому применению метода расщепления по цистеину с целью получения крупных фрагментов препятствует то обстоятельство, что С-концевой фрагмент блокирован по аминогруппе остатком иминотиазолидина. Попытки деблокирования с помощью классического секвенирования по Эдману дали отрицательный результат [96]. Таким образом, полученные пептиды, за исключением N-концевого, не могут быть использованы для прямого секвенирования. Недавно предложен метод модификации указанных пептидов на никеле Ренея [133]. После обработки защищенных пептидов активным (нейтральным) катализатором W-6 в нейтральной среде при 50 °С в течение 6—10 ч происходит мягкое десульфирование с образованием N-аланилпептидов с выходом 90% [9]. В ходе реакции цистеин и метионин с высокой скоростью превращаются в аланин и а-аминомасляную кислоту соответственно.

2.7.1.1. Методика [133]. Десульфирование проводят в 0,05М трис-НС1-буфере (рН 7) при 50°С. Готовят никель Ренея W-6 [9]. Смесь 20 мг пептида и 200 мг катализатора в 50 мл буферного раствора нагревают до кипения в течение 7 ч в атмосфере азота. Жидкость над осадком фильтруют через колонку (0,6x5 см) с комплексообразующей смолой Chelex-100. Пептиды элюируют 1 М аммиаком, элюат высушивают лио-фильно. Благодаря высокому выходу в реакциях расщепления и последующего десульфирования иминотиазолидинпептидов эта методика вполне может использоваться в химии белка с целью получения крупных фрагментов.

122 2. ФРАГМЕНТАЦИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ ХИМИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ

2.8. Другие методы химического расщепления пептидных связей

2.8.1. Расщепление связи Asn-Gly

Свойство гидроксиламина специфически расщеплять пептидную связь фрагмента Asn-Gly (81) успешно используется на практике при структурных исследованиях белков и крупных пептидов. Метод основан на способности боковой цепи остатка аспарагина циклизоваться с образованием замещенного сук-цинимида (82), который затем подвергается нуклеофильной

-nhch—co-nh -сн2—со I

сн2—со—nh2 81

nh—сн —со.

сн2-С(К 82

NH2OH

n—сн2—со-~+ nh,

-^nh—сн—conhoh ~ nh~ch-<:ooh + h2nch2co-

| +h2nch2co- j

сн2соон сн2 conhoh

атаке со стороны гидроксиламина [13]. Повышенная лабильность связи Asn-Gly по сравнению с другими связями Asn-X, по-видимому, обусловлена относительной легкостью циклизации при отсутствии пространственных ограничений со стороны боковой группы ближайшего аминокислотного остатка (глицина). Известно, что некоторые эфиры глутаминовой кислоты в пептидах также образуют циклические соединения, однако расщепления связи Gln-Gly под действием гидроксиламина не наблюдается.

Методика расщепления гидроксиламипом описана в работе [11]. Более поздние публикации посвящены в основном различным модификациям этой методики, включающей повышение концентрации гидроксиламина, проведение реакции при несколько повышенной температуре, более низком рН, использование в качестве растворителя 6 М гуанидин-HCl и гидроксида лития для установления рН среды.

2.8J.1. Методика [44]. 102 мг легкой цепи фактора Xi (в виде S-пиридил-этилпроизводного) растворяют при 20 °С в 25 мл 6 М гуанидин-HCl, содержащего 2% солянокислого гидроксиламина, и подтитровывают 4,5 М LiOH до рН 9,0. В ходе реакции рН поддерживают с помощью 4,5 М LiOH. Оптимальное время проведения реакции составляет 4 ч.

2.8. ДРУГИЕ МЕТОДЫ

123

2.8.2. Расщепление по остатку пролина

Третичные амины расщепляются под действием металлического натрия в жидком аммиаке до альдегидов и вторичных аминов [10]. Впервые расщепление в этих условиях N-пептидной связи пролина наблюдали в 1961 г. [85]. В связи с этим были предприняты попытки [8, 207] использовать растворы Na в NH3

R гн,-сн2 F ? /н-сн;

-NHCHCO-N^ * ! —-NHCH-C -Н + HNx |

Vh___си СИ— СН:

сн сн2 84 !

СО- NH^ CO-NH-

83 к

-~~NH-CH—СН2ОН

86

85

для расщепления связи пролина в белках. В ходе реакции аминокислота, предшествующая остатку пролина, превращается в соответствующий альдегид (84) или спирт (85) с одновременным отщеплением второго фрагмента с N-концевым проли-иом (86) [181, 207]. Однако метод не свободен от недостатков, главным из которых является неспецифическое расщепление и деградация аминокислот, неустойчивых в щелочной среде. Вследствие этого предприняты попытки несколько модифицировать исходную методику. Гидразид натрия в среде гидразин— эфир при 0°С в течение 45—60 мин расщепляет модельные пептиды и В-цепь инсулина с выходом 70—100% [ЮЗ]. Для расщепления модельных пептидов (с остатком пролина), грамицидина и тироцидина С использовали алюмогидрид лития в безводном тетрагидрофуране [154, 155].

2.8.3. Расщепление по остатку гистидина

Двойная связь в у—б-положении имидазольного кольца гистидина в сущности аналогична двойной связи, присутствующей в остатках триптофана и тирозина. На практике пептиды расщепляются по остатку гистидина под действием N-бромосукци-пимида, хотя и с меньшим выходом, чем по триптофану [170, 171]. Предположительный механизм реакции, по-видимому, включает образование пятичленного иминолактона, который легко гидролизуется в кислой среде по аналогии с расщеплением пептидов по триптофану и тирозину [181]. Расщепление гистидинсодержащих пептидов N-бромосукцинимидом проводят в пиридин-ацетатном буфере (рН-3) при 100°С в течение 1 ч.

124 2. ФРАГМЕНТАЦИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ ХИМИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ

С целью исключить возможность расщепления по триптофану и тирозину О-ацилируют остатки тирозина [170] и избирательно алкилируют остатки триптофана с помощью 2-гидрокси-5-нитробензилбромида [206]. Из-за низкого выхода и окисления боковых групп некоторых аминокислот, в особенности серусо-держащих, эта методика редко применяется для фрагментации белков и пептидов.

2.8.4. Расщепление по остатку дегидроаланина

Некоторые производные ссрина и цистеина (87) в пептидах легко вступают в реакцию ^-элиминирования с последующим расщеплением пептидной связи по а-углеродному атому де-гидроаланилпептидов (88).

сн2

il

~ СО--NH—С—СО—NH ^

88

н3о СНз

X = OR; SR | R = Н; СН3; электрофильные группы — CONH2 + СО—СО—NH -

S9

У производных серина, несущих сильные электроноакцептор-ные группы по гидроксилу, такие, например, как О-тозильная [138] или О-дифснилфосфорная группы [149], процесс fj-эли-минирования индуцируется в основной среде. Например, химотрипсин путем тозилироваиия по остатку серина активного центра с помощью тозилфторида и последующей обработки основаниями превращается в дегидрохимотрипсин [184, 201].

Цистеин превращается в дегидроаланин при S-нитроари-лировании остатка цистеина динитрофторобензолом и последующей обработке 0,1 М щелочью [178]. S-Метилсульфоний превращается в дегидроаланин при более низких рН (8,5—9) по сравнению с S-динитрофенилпроизводными [179].

При обработке пептидов щелочью остаток дегидроаланина (91) образуется непосредственно из цистина (90). Расщепление дисульфидной группы инициируется благодаря атаке гидро-ксил-ионом протона при а-углеродном атоме с образованием остатка S-тиоцистеина (92), который затем превращается в цистеин и свободную серу [189].

Н2С^-Х -CO-NH4-C—СО- NH-

N

н

87

2.8. ДРУГИЕ МЕТОДЫ

125

—NH-C—СО-

II 91 СН2

+ S"

I

S" -> CH2 + S

i I

S — NH— CH-CO —

I

сн2

I

— HN—СН COv~ 92

Расщепление связи С—S может проходить по обеим сторонам дисульфидного мостика, следовательно, при щелочной обработке цистинсодержащих пептидов образуется сложная смесь дегидроаланинсодержащих производных. Дегидроаланил-пептиды расщепляют с помощью гидролиза или окисления [178]. В надмуравьииой кислоте идет окисление дегидроаланина в а,р-дигидроксиаланин, который затем гидролизуется при рН 10 до пептида с амидной группой и фрагмента, несущего на N-конце остаток гидроксипировиноградной кислоты. Расщепление проводят также путем бромирования в водной уксусной кислоте с образованием в качестве промежуточного продукта лабильного а,^-дибромоаланина. В присутствии брома идет расщепление пептидных связей остатков триптофана, тирозина и гистидина [181].

Вместе с тем методу расщепления пептидной связи через промежуточное образование дегидроаланина свойственны существенные недостатки. Остаток дегидроаланина (93) может вступать в реакцию с нуклеофилами, например с е-амиио-группой остатка лизина (94) с образованием DL-ct-амино-^-

-^ СН2—NH-(СН2)4

I I

-^NH—СН—СН—NHCHCO — 95

(e-N-L-лизин)пропионовой кислоты (лизиноаланина) (95) [12]. В щелочной среде в присутствии пероксида водорода может идти окисление боковых групп ряда аминокислот, что приводит к глубокой модификации пептидов. Обработка щелочью может сопровождаться побочными реакциями, например транспептидацией, гидролизом амидных групп, а также неспецифическим расщеплением пептидных связей.

н soh

-nh-4:—со~^ Ч

сн2

а

I

S

I

сн2

I

-nh—сн—со — 90

h2n-(ch2u

I

- n н—с^-со-^ — nhchco-* 93 94

сн2

h

126 2. ФРАГМЕНТАЦИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ ХИМИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ

2.8.5. Другие методы расщепления пептидных связей

Низший аналог метионина — S-метилцистеин (96)—не вступает в реакцию с бромоцианом с последующим расщеплением

-NH—CH—СО—NH —

I

СН2 -ch3scn -^NH—СН-СО

I —X— I I

S-~*CN СН2—О

| h

СН3 Вг 97 96

пептидной связи по карбоксильной группе. В отличие от реакции с метионином в этом случае не образуется соответствующий (3-лактон (97). В том случае, если аминогруппа S-метил-цистеина ацилирована или аминоацилирована (98), реакция идет с образованием оксазолиний бромида (99) и метилтио-

CHjCO-NH— СН—CO--NH СН3СО—NH—СН СО—NH

R ^СН CONH^ R СН CONH^

СН; * СН2

I I v I "

Sr-C-Вг *S-CN + Вг

! HI I СНзN СН3

96 98 1

П (гС,ь сут

СНзСО—NH-CH—СО NHi СН3СО NH- СН С—NH

III I I ;

R О^ ^CH-CONH R О. XH-CONH^I

СН2 СН2

100 99 |

CH3CO—NH-CH-CONH2 СН3СО—NH—СН—CO--NH |

1 I I « 1

R R JZ^

+ СНГ CONH-^

СН3-СО -CONHvx,

цианата [70]. При низкой температуре соединение 99 легко гидролизуется в О-ацилпроизводное (О-серилпептид) (100) (по механизму а). Наконец, указанный эфир гидролизуется далее с образованием ожидаемых фрагментов. При высокой температуре идет реакция ^-элиминирования с образованием пептида с дегидроаланином (по механизму б). Реакция с успехом применялась в отношении некоторых S-метилцистеинсодер-жащих пептидов.

2.8. ДРУГИЕ МЕТОДЫ

127

Известен метод расщепления пептидных связей серина и треонина (101), основанный на предварительном окислении гидроксильной группы дициклогексилкарбодиимидом в присутствии фосфорной кислоты в диметилсульфоксиде (102) и

^CONH—СН—CONH~ ^CONH—СН—CONH^ I дмсо/дцк i

CH-OH НзРо4"» СО

R R

101 QHsNHNH,/^ 102

I

I IMHjOH

t

--CONH CH- CO- NH^ ^CONH—CH-CO— NH^

i v 1 i

XV NH Л R N C6H5 К N H

103 105

^CO--NH CH-CO ^ u м -^CONH—CH-CO

I +H2N^ , 1 + H2N^v

^ ^N-C6H5 /сч./° R N R N

104 106

R*H,CH3

последующей реакции с фенилгидразином при 20СС в течение нескольких часов или при 40—70 °С в течение 20—40 мин. В ходе реакции промежуточный фенилгидразон (103) цикли-зуется в пиразолон (104) с одновременным отщеплением фрагмента со свободной N-концевой аминогруппой. Возможен и другой вариант, когда при действии гидроксиламина образуется промежуточный гидразон (105), который затем циклизуется в изооксазолинон (106) с образованием фрагмента со свободной аминогруппой [36, 37]. В опытах на модельных пептидах получен достаточно удовлетворительный выход продуктов реакции, однако по всей вероятности метод неприемлем для структурного анализа белков. Недавно опубликованы данные о расщеплении белков по остатку аспарагиновой кислоты под действием разбавленной НС1 (рН 2) или разбавленной муравьиной кислоты при 108°С в течение 2 ч. В этих условиях расщепляются большинство пептидных связей по аспарагиновой кислоте. Одновременно наблюдалось частичное деамидирова-ние аспарагииа в инсулине и дезацетилирование N-концевогО' глицина в цитохроме с.

328

2. ФРАГМЕНТАЦИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ ХИМИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ

2.9. Заключение

В настоящее время известен ряд химических методов расщепления пептидных связей по остаткам отдельных аминокислот. Возможность практического применения реагента или метода определяется главным образом специфичностью и полнотой реакции. В настоящей главе детально рассмотрены те методы, которые в прошлом и, по-видимому, в будущем нашли и будут находить практическое применение именно потому, что наиболее полно удовлетворяют этим двум требованиям.

Благодаря высокой специфичности и почти количественному выходу продуктов реакции расщепление бромоцианом по ¦остатку метионина находит широкое применение в химии белка. Созданы и п

страница 18
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
купить букет из альстромерий в москве
Рекомендуем компанию Ренесанс - складная лестница - оперативно, надежно и доступно!
стул изо
депозит хранения вещей

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(10.12.2016)