химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

угие продукты), находящийся в равновесии с его открытой формой (аналогично реакции с N-бромосукцинимидом) [137]. В условиях проведения реакции идет частичное бромирование свободного тирозина с образованием бромотирозина и окисление свободного метионина до метионин-Б-оксида. Полагают [51], что в присутствии кислоты нуклеофил (индолил, фенол или тиоэфир) атакует атом брома полярной молекулы «псевдогалогена» CNBr с образованием

112

2. ФРАГМЕНТАЦИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ ХИМИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ

HCN и соответствующего бромпроизводного, который в конечном счете перегруппировывается в другие соединения (окси- и диоксоиндол, сульфоксид):

Nu:^Br -C = N:"^H +

Однако не исключено, что бромирование вызвано примесью брома, присутствующего в бромоциане.

2.5.4.1. Методика [135]. Апоцитохром (0,1—0,5 мкмоль) растворяют в 2 мл смеси (1 : 1) 88%-ной муравьиной и гептафторомасляной кислот, прибавляют 700 мг бромоциана и инкубируют без доступа света в течение 24 ч. Реагент п растворители отгоняют в потоке азота, остаток растворяют в 10 мл воды н высушивают лиофильно. Остаток растворяют в 9 М уксусной кислоте и хроматографируют на колонке с сефадексом G-50.

2.5.5. Расщепление по остатку триптофана о-иодозобензойной кислотой

Согласно предложенному методу; белок в 80%-ной уксусной кислоте обрабатывают о-иодозобензойной кислотой в присутствии 4 М гуанидин-HCl [120]. Реакция идет избирательно с выходом 70—100%. Однако последующие исследования показали, что метод не столь специфичен, а выход не столь высок, как сообщалрсь [51—54, 99, 198]. По выходу продуктов реакции предложенная методика сопоставима с другими, где происходит расщепление по триптофану; кроме того, побочно идет расщепление по остатку тирозина. Более детальные исследования показали [52, 53], что в указанных условиях (80%-пая уксусная кислота, 4 М гуанидин-HCl) происходит окислительное галогенирование иидолыюго ядра триптофана и бензольного кольца тирозина с одновременным расщеплением пептидной связи. Если из реакционной смеси исключить галоген, расщепления пептидной связи не происходит. Механизм реакции, вероятно, аналогичен другим реакциям с использованием галогенирующих реагентов (в том числе N-бромосукцинимида). Высказано предположение, что при инкубации 5-иодозобензойной кислоты в кислой среде в присутствии галогенов идет несколько равновесных реакций с образованием ряда промежуточных галогенирующих соединений, включая свободный галоген [уравнение (2.16)]. Следовательно, окислительное галогенирование, приводящее к расщеплению по триптофану и тирозину, обусловлено свойствами системы о-иодозобензойная кислота — 4 М гуанидин-HCl, а не присутствием примесей в реагентах, например о-иодоксибензойной кислоты [121, 122]. На практике чистоту реагентов проверяют

2.5. РАСЩЕПЛЕНИЕ ПО ТРИПТОФАНУ

па

с помощью различных тестов [52, 53]. С целью свести к минимуму расщепление пб тирозину в реакционную смесь предложено добавлять я-крезол [52, 122]. С такими изменениями метод вполне может быть использован для расщепления белков по остатку триптофана.

НООС С6Н4 Ю + 2Н + + 2СГ НООС—С6Н4-[С)2 + Н20 (2.16)

2.5.5. J. Методика [122]. о-Иодозобензойиую кислоту (10 мг) растворяют в 80%-ной уксусной кислоте, содержащей 4 М гуанидин-HCl и 20 мкл л-кре-зола, и инкубируют при 20 °С в течение 2 ч. Затем прибавляют образец белка (5 мг) и инкубируют без доступа света при 20 °С в течение 24 ч. Пептидные фрагменты выделяют с помощью гсль-фпльтрацпи на сефадексе.

2.5.6. Другие реагенты

Расщепление по триптофану можно проводить с помощью окислительного галогенировапия «активным иодом», который генерируется в системе пероксид водорода — соли иодоводо-родной кислоты —лактопероксидаза (или пероксидаза хрена). Простые пептиды, содержащие остаток триптофана, расщепляются при рН 5 в течение 10 мин с выходом 30—40%. Для проведения реакции необходимо присутствие всех компонентов указанной системы. С аналогичным выходом идет расщепление по триптофану с помощью других иодирующих агентов, таких, как 12, Ь~, IC1 и хлороамин T/KI [1]. Вопрос о возможности применения галогенировапия в присутствии пероксидазы с целью расщепления белков остается открытым, однако метод заслуживает внимания

2.5.6.1. Расщепление по триптофану под действием N-хлоросук-цинимида. Пептидные связи по карбоксильной группе триптофана избирательно расщепляются в кислой среде под действием N-хлоросукцинимида; остальные пептидные связи при этом не затрагиваются. Опыты на модельных соединениях показали, что как выход, так и скорость реакции здесь несколько меньше, чем в случае N-бромосукцинимида. Однако реакция идет очень избирательно и никаких признаков расщепления по тирозину и гистидину не наблюдается. Пептидные связи триптофана в се-лактальбумине, ингибиторе трипсина (ингиби-

ноос—с6н4 icr + с1

НООС—С6Н4— I

+ С12

8—703

114

2. ФРАГМЕНТАЦИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ ХИМИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ

тор Куница), миоглобине и глюкагоне расщепляются под действием N-хлоросукцинимида в водной уксусной кислоте с выходом 19—58% [172]. В некоторых работах [115] рекомендуют вводить в состав реакционной смеси мочевину (далее приводится именно эта методика).

Методика. Концентрация белка в реакционной смеси составляет 0,286 ммоль/л, молярное отношение белок: N-хлоросукцинимид варьирует в зависимости от объекта исследования. Рабочий буфер содержит 27,5%-ную уксусную кислоту и 4,68 М мочевину. Реакцию проводят при 20 °С в течение 30 мин и прерывают путем добавления Ы-ацетил-^-метионина [172J. Согласно типовой методике, образец белка растворяют в дистиллированной воде (1 нмоль/мл) и смешивают (в объемном соотношении 4:10) с раствором N-хлоросукцинимида в буфере (1 мл ледяной уксусной кислоты + 1 г мочевины 4- 1 мл воды).

В образцах цитохрома с из различных источников расщепление по триптофану проходит с выходом ~50%.

2.5.6.2. Расщепление с помощью трибромокрезола [137]. Избирательное расщепление белков и пептидов по пептидным связям триптофана проводят с помощью 2,4,6-трибромо-4-ме-тилциклогексадиенона (трибромокрезола) (59). Пептидные связи тирозина и гистидина, которые обычно расщепляются под действием 4 бромирующих реагентов, таких, как N-бромо-сукцинимид, в этих условиях не затрагиваются. Однако тирозин превращается в 3,5-дибромо-производное, цистеин окисляется в цистеиновую кислоту, метионин — в метиопин-Б-оксид, идет остатка гистидина. Оптимальными условиями расщепления по триптофану являются следующие: 3 экв. трибромокрезола, рН 3, 20°С, 5—15 мин. В случае лизоцима селективное расщепление идет с выходом 5—60%. Принято считать, что реакция идет по механизму окислительного галогенировапия, как и в случае N-бромосукцинимида.

Методика. К раствору глюкагона (0,5 мкмоль) в 2 мл 70%-ной уксусной кислоты прибавляют 25 мкмоль трибромокрезола в 50 мкл диоксана. Инкубируют при перемешивании в течение 15 мин, а затем хроматографируют в 0,1 М уксусной кислоте на колонке с сефадексом G-25.

2.5.7. Озонирование

При озонировании пептидов в безводной муравьиной кислоте остаток триптофана превращается в N-формилкинуренин (60) [125, 141, 142, 195, 196]. При последующей кислотной обработке в мягких условиях идет отщепление N-формильной группы. При непродолжительном (до 4 ч) нагревании пептидов с модифицированным остатком триптофана (в виде кинуренина

2.5. РАСЩЕПЛЕНИЕ ПО ТРИПТОФАНУ

315

или N-формилкинуренина) в бикарбонатном буфере с выходом 49—59 % идет избирательный гидролиз пептидной связи. Принято считать, что активация пептидной связи обусловлена внутримолекулярным каталитическим эффектом у-кетогруппы N-формилкинуренина [143].

/С°^ ^ ГОСН2СН

N ^ N—СНО

н н

60

При инкубации пептидов, содержащих N-формилкинуренип, в 0,2 М гидразин-ацетатном буфере (рН 3,6) при 100 °С в течение 2 ч образуются гидразоны (61), которые затем циклизу-ются в тетрагидропиридазоны (62) с одновременным расщеп-

,nh; nh n c'o-nh n ч'о

NCHO Mb Н

61 62

лением пептидной связи. Выход составляет 35—68%, однако при действии гидразина наблюдается неспецифическое расщепление [125—127]. При восстановлении кинуренинпептидов с помощью NaBH4 [144] или электролитическим способом [63] кинуренин превращается в у~(°"аминоФенил)гомосеРин (63) с последующим расщеплением С- и N-пептидных связей остатков триптофана с выходом 20—40%.

он co-fNHvv .сн—сн2—сн

NH-^-CO^'

^NH2

63

Расщепление С-пептидной связи триптофана путем озоно-лиза не применяется в химии белка из-за низкого выхода, окисления цистеина (в цистеиновую кислоту), метионина (в метионин-5,5-диоксид) и отчасти тирозина.

8*

116 2. ФРАГМЕНТАЦИЯ ЛОЛИПЕПТИДОВ ХИМИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ

2.6. Расщепление по остатку тирозина

2.6.1. N-Бромосукцинимид

При отсутствии в молекуле белка остатков триптофана избирательное расщепление по тирозину можно проводить с помощью N-бромосукцинимида [33, 148, 165]. При наличии триптофана пептидные связи тирозина будут расщепляться только при большом избытке реагента. По всей вероятности, расщепление по тирозину идет по следующему механизму.

он о

*^NH—СН—СО—NH^ /~HN—СН-С—NH~*

64 65

о о

67 66 Н Н

Остаток тирозина при взаимодействии с 2 экв. N-бромосукци-пимида бромируется с образованием о/о'-дибромотирозина, который при реакции с 1 экв. (третьим) реагента превращается в трибромодиенон (65). Последний вступает в 1,5-взаимо-действие с карбонильной группой, образуя спиро-у-иминолак-тон (66), легко гидролизующийся до дибромодиенонспиролак-тона (67) и пептидного фрагмента со свободной аминогруппой. Диенонспиролактон, который был выделен и идентифицирован [33, 165], —сильный хромофор с Ятах = 260 нм (е = 10000ч-Ч-11 ООО). В случае простых пептидов контроль за ходом реакции можно вести по поглощению при 260 нм. N-Пелтидная связь остатка тирозина устойчива в кислой среде при избытке N-бромосукцинимида.

2.6. РАСЩЕПЛЕНИЕ ПО ТИРОЗИНУ

117

На модельных пептидах с N-концевым тирозином показано [208], что свободная сс-аминогруппа тирозина принимает участие в альтернативной последовательности реакций, вклю чающей внутреннее присоединение по Михаэлю в промежуточном трибромодиеноне (70) с образованием в конечном счете

дибромо-6-гидроксииндол производного (73) (последовательность реакций 68-^-73).

Расщепление с помощью N-бромосукцинимида пептидной связи тирозина успешно применяется в структурных исследованиях белков и пептидов. В случае S-карбоксиметилрибону-клеазы, не содержащей триптофана, пептидные связи шести остатков тирозина расщеплялись с выходом 30—65% [148, 181]. Поскольку гистоны не имеют триптофана, но содержат тирозин, расщепление N-бромосукцинимидом находит широкое применение при анализе этих белков [19, 147]. Выход обычно неколичественный, но улучшается при избытке реагента (в последнем случае могут идти побочные реакции по остаткам гистидина и серусодержащим аминокислотам).

2.6.1.1. Методика [86]. К раствору гистона Ht (1 мг/мл) в 50%-ной уксусной кислоте прибавляют N-бромосукцинимид (0,09 мг/мг белка,. После инкубации при 20 °С в течение 2 ч к реакционной смеси добавляют вторую порцию N-бромосукцинимида, равную первой, и вновь инкубируют в течение 4 ч.

118 2. ФРАГМЕНТАЦИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ ХИМИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ

В заключение 10-кратно разбавляют дистиллированной водой и высушивают лиофильно. Пептидные фрагменты фракционируют в 0,01 М HCI на колонке с сефадексом G-100.

2.6.2. Другие реагенты

В реакции окислительного расщепления пептидной связи тирозина N-иодосукцинимид столь же эффективен, как и N-бромо-сукцинимид. Реакцию проводят при рН 4,5, выход на модельных соединениях и простых тирозинсодержащих пептидах составляет 25—95%. Механизм реакции идентичен расщеплению с помощью N-бромосукцинимидом [100]. Показано, что пептидная связь тирозина расщепляется с умеренным выходом при электролитическом окислении на платиновом электроде. При этом в отличие от реакции с N-бромосукцинимидом не наблюдается расщепления по триптофану и гистидину; однако идет окисление других функциональных групп (имидазоль-иых, тиоэфирных, дисульфидных и аминогрупп), правда с меньшей скоростью, чем фенольных групп тирозина. С помощью этого метода были специфически фрагментированы по остатку тирозина ангиотензии, инсулин и рибонуклеаза [30].

2.7. Расщепление по остатку цистеина

В основе метода избирательного расщепления пептидной связи по аминогруппе остатков цистеина лежит превращение SH-групп в тиоциановые группировки [183]. Впервые о расщеплении пептидной связи цистинсодержащих белков под действием цианидов сообщалось в 1964—66 гг. [23, 24]. Образование остатков тиоцианоаланииа (74), который циклизуется

^NHCHCO^

СН2

^СО—NH—СН—СО^

2

+

y^NHCHCO™

NHCHCO^

74

нч

HN

Ч^сн2

сн2

сн—СО^

wCOOH

+ HN

сн—со^

75

76

2.7. РАСЩЕПЛЕНИЕ ПО ЦИСТЕИНУ

П9

в ацилиминотиазолидин (75), сопровождается быстрым гидролизом пептидной связи с образованием N-коицевого пептида и С-концевого 2-иминотиазолидин-4-карбоксильного фрагмента (76) с достаточно высоким выходом. Поскольку расщепление дисульфидных связей цианидами приводит к частичному и случайному образованию тиоцианогрупп, следовало рассчитывать на получение сложной смеси пептидов. Однако на практике при обработке бычьей рибонуклеазы 1000-кратным избытком цианида при рН 8 и 37 °С в течение 48 ч образуется 9 пептидов. По аминокислотному составу полученные фрагменты соответствуют известной структуре рибонуклеазы, а также фрагментам, полученным путем расщепления по N-ацильным связям всех восьми остатков полуцистина [24].

SCN SNa

79

Предложен метод прямого и количественного превращения SH-групп белков в соответствующие тиоцианопроизводные с помощью 2-нитро-5-тиоцианобензойной кислоты (78) [38, 39] [уравнения (2.17) и (2.18)]. Реагент синтезируют по реакции 5,5'-дитиобис- (5-нитробензойной) кислоты с цианидом натрия [уравнение (2.17)]. 2-Нитро-5-тиоциаиобензойная кислота довольно мягкий и избирательный цианирующий реагент по SH-группам; его высокая реакционная способность связана с легкостью замещения серусодержащим нуклеофилом легко отщепляющегося я-нитротиофенола [уравнение (2.18)]. Меченый реагент получают путем расщепления реактива Эллмана с помощью Na14CN. Таким способом можно ввести радиоактивную метку в остаток тиоцианоаланина и следить за скоростью образования меченых 2-иминотиазолидинпептидов.

Показано также, что активным цианирующим агентом SH-групп в белках являются соли 1-циано-4-диметиламинопириди-ния (80) [199]. Реакцию проводят в нейтральной или кислой

120 2. ФРАГМЕНТАЦИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ ХИМИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ

среде, например в 0,1 М ацетатном буфере (рН 2—7), содержащем 7 М мочевину, при 25 °С в течение 11 мин и при трехкратном молярном избытке реагента.

Двухстадийная методика циа-•иу /сн3 нирования включает в качестве

N первого этапа обработку цистеин-

^\ содержащего белка реактивом Эл-

I |) Х"-вг лмана в мягких щелочных условн-

ей'"J х" bf4 ях (разд. 2.2.2.4). Затем смешан-

I по4 ный дисульфид расщепляется под

CN действием цианида в тиоцианоала-

so пинпроизводное белка и анион 2-

нитро-5-тиобензоата [194]. Было показано также, что аналогичная д

страница 17
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
обучение специалистов по отоплению и водоснабжению»
KNSneva.ru - предлагает сервера супермикро - поставщик техники для дома и бизнеса в Санкт-Петербурге.
курсы маникюра на юго-западной
Компания Ренессанс: лп-11 - всегда надежно, оперативно и качественно!

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(05.12.2016)