химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

превращается в 3-галогенооксоиндол (40), который благодаря нуклеофильной атаке кислорода карбоксильной группы триптофана по углеродному атому (индольного ядра), связанному с галогеном, превращается в иминолактон (42). Последний легко гидролизуется в N-ацилдиоксоиндолилаланинлактон (43) (находящийся в равновесии с открытой формой аминокислоты), который становится С-концевым аминокислотным остатком пептидного фрагмента.

41 '

42

Факт, что оксоиндол является промежуточным соединением в последовательности реакций расщепления, был четко показан на примере цитохрома с сердца лошади [51, 163]. Единственный в белке остаток триптофана вначале избирательно окисляли в производное оксоиндола, а затем проводили бромирование в системе НВг —ДМСО.

Последовательность реакций (37-^43) включает также еще

104

2. ФРАГМЕНТАЦИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ ХИМИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ

один путь, согласно которому 3-галогенооксоиндолилаланин (40) наряду с циклизацией до 42 гидролизуется в диоксоиндо-лилаланин (41). Избирательное (или предпочтительное) расщепление пептидных связей по диоксоиндолилаланину может быть достигнуто мягким кислотным гидролизом [162]. Выдвинутое в работе [20] предположение об анхимерном содействии Y-гидроксигруппы катализируемому кислотами гидролизу алифатических амидов убедительно подтверждается легкостью и селективностью гидролиза пептидной связи в токсичном циклопептиде фаллоидине, при котором у-гидроксигруппа способствует расщеплению пептидной связи [204, 205].

Н

43

Установлено также, что расщепление пептидной связи при окислительном галогенировании может идти и по аминогруппе остатка триптофана, хотя и с низким выходом [123, 162, 163]. Если глицилтриптофан инкубируют с BNPS-скатолом (разд. 2.5.2) в 75%-ной уксусной кислоте при 37 °С в течение 24 ч, с выходом 20% образуется свободный глицин [123]. При расщеплении пентапептида Phe-Val-Gln-Trp-Leu в системе ДМСО — галогеноводород в уксусной кислоте и последующем подкислении до рН 2 (60 °С, несколько часов) кроме ожидаемого остатка лейцина в смеси идентифицируют свободный диоксоиндолилаланин (и/или его лактон). На кривой элюирования с аминокислотного хроматографа не было обнаружено других аминокислот [163].

2.5. РАСЩЕПЛЕНИЕ ПО ТРИПТОФАНУ

105

Расщепление по аминогруппе триптофана можно представить в виде последовательности реакций 44-^48, в которой в результате расщепления С-пептидной связи триптофана по механизму окислительного галогенирования образуется фрагмент с С-концевым оксоиндолилаланином (44), который затем

С)

н

со

о

-—f—СН2СНСООН

н

47

5

CHR

О " v NH СО- CHR — ^ ^ NH

"] ' i ! ч [ - СООН

N Ч) ' - ^ N * О

н

44 45

CHR %

CHR

NH2 О ^NH

СООН

N ^О Н

46

ОН NH2

(\ -^сн2снсоон +HOOC__CHR

Н

48

через промежуточный 6-членный интермедиат иминолактона (46) превращается в 48.

Расщепление пептидной связи по аминогруппе триптофана можно также объяснить 1—6-взаимодействием по аналогии с механизмом реакции бромоциана с метионином без расщепления пептидной связи [22] (разд. 2.4.1). В случае метионина образуется производное О-аминоацилгомосерина, которое, по-видимому, устойчиво в водной среде (например, в 70%-ной муравьиной кислоте). В случае триптофансодержащих пептидов идет образование соответствующего О-аминоацильного произ-

106 2. ФРАГМЕНТАЦИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ ХИМИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ

водного с группой третичного алкилового эфира (51), который, полагают, гораздо более лабилен в кислой среде. Возможный механизм 1—6-взаимодействия представлен последовательностью реакций 49->52.

СО — NH^A

I

СН2СН

I

q NH—СО^В

49

\ ~* 5

44 + H2NwA

50

В^СООН

В^СО

I

о

NH3

-CHXH—CO—NH^A

h*/ha()^ i

51

CH2CH CO-NH^A

свободный

гидроксоиндолилаланин -+- H2N A

В этой связи интересно отметить, что имеются сведения [196] о расщеплении в условиях мягкого гидролиза по аминогруппе и карбоксилу у-фенилгомосерилпептидов (53), близких в структурном отношении как гомосерину (54), так и пептидам с диоксоиндолилаланином (55). Пептиды с N-коицевым триптофаном не расщепляются галогенирующими реагентами [181]. Возможно, что с бромоиндоленином (37) преимущественно взаимодействует не карбоксиамидная группировка, а а-ами-ногруппа триптофана с образованием трициклического производного, что исключает расщепление пептидных связей [131]. Подобное участие в реакции свободной аминогруппы было

2.5. РАСЩЕПЛЕНИЕ ПО ТРИПТОФАНУ

107

обнаружено в случае N-тирозилпептидов, которые также не расщепляются N-бромосукцинимидом [208] (разд. 2.6).

он со—NH—

I

СН2СН2—СН

NH—СО—

53 54

ОН

и

55

УФ-спектры пептидных фрагментов, полученных окислительным галогенированием, свидетельствуют о присутствии в молекуле С-концевого диоксоиндолилаланина или его лактона (последовательность 37->43). Диоксоиндолилаланин в воде характеризуется Amax = 253 нм (е = 4070), Яшах = 287 нм (е = 1220) (Ятт = 230 и 277 нм). Соответствующий лактон имеет аналогичный максимум поглощения при 253 и 300 нм [66, 161, 163]. При проведении реакции с N-бромосукцинимидом или другими галогеиирующими агентами образуются 5-бромодиоксоиндоли-лаланип (Ятях = 261 и 302 нм) и/или его лактон (Хтах = 261 и 310 нм) [76, 123]. УФ-спектр оксоиндолилаланина не имеет Аталх в области 270—300 нм и характеризуется Ятш при 250 нм и плечом при ~280 нм. Если пептидные фрагменты содержат другие хромофорные группы (например, тирозин), УФ-спектр в области 250—300 нм изменится.

Следует иметь в виду, что расщепление пептидной связи тирозина окислительным галогенированием обычно проводят в 50—80%-ной уксусной (или муравьиной) кислоте при комнатной температуре в течение нескольких часов по аналогии с расщеплением бромоцианом (разд. 2.4.1). Это довольно жесткие условия, при которых возможны побочные реакции, такие, как дезамидирование или расщепление лабильных пептидных связей (Asp-Pro). Фрагменты с С-концевым диоксоиндолилепи-ролактоном фиксируют ковалентно через 3-аминопропильную группу макропористого стекла с целью твердофазного секвенирования по Эдману [197].

ОН СО—NH—

I I

асн—сн2—СН NH—CO-

CO—NH—

I

СН

I

NHСО—

108

2. ФРАГМЕНТАЦИЯ ПОЛИПЕПГИДОВ ХИМИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ

2.5.2. Расщепление с помощью BNPS-скатола

В настоящее время для расщепления пептидов и белков по остатку триптофана применяют главным образом 2-(2-нитро-фенилсульфенил)3-бромо-3-метилиндоленин (57) (BNPS-ска-тол) [45, 50, 132]. Реактив готовят путем бромирования 2-(2-нитрофенилсульфенил) 3-метилиндола (56) N-бромосукцинимидом в ледяной уксусной кислоте [132]. В работе [211] предложен модифицированный метод получения BNPS-скатола и спектроскопически подтверждена его «индолениновая» структура.

56 57

BNPS-скатол действует более избирательно по сравнению с N-бромосукцинимидом. После обработки смеси аминокислот BNPS-скатолом (10 экв.) в 50%-ной уксусной кислоте при комнатной температуре в течение 30 мин в реакционной смеси полностью исчезает триптофан, метионин превращается в ме-тионин-Б-оксид, а остальные аминокислоты обнаруживаются в гидролизате количественно. Напротив, при аналогичной обработке N-бромосукцинимидом в гидролизате отсутствует не только триптофан, но и метионин, тирозин, гистидин, цистин. Как и следовало ожидать, цистеин легко окисляется BNPS-скатолом до цистина, а при избытке реагента — частично до цистеиновой кислоты. При наличии в белке SH-групп их предварительно защищают, используя подходящий реагент [132].

Как было убедительно показано на примере пуклеазы [132], для расщепления по триптофану необходима продолжительная инкубация в присутствии избытка реагента (20— 100-кратпого). При сокращении времени и небольшом избытке реагента можно обнаружить лишь частичную модификацию триптофана.

Известны многочисленные работы по применению BNPS-скатола в химии белка [51]. Выход продуктов избирательного расщепления по триптофану составляет 40—80%. По-видимому, выход зависит от качества реагента. BNPS-скатол чувствителен к действию света, разлагается при комнатной температуре, темнеет и выделяет бром. В то же время высокоочищен-

2.5. РАСЩЕПЛЕНИЕ ПО ТРИПТОФАНУ

109

ные кристаллические препараты (бледно-желтые звездочки при кристаллизации из лигроина [132]) могут храниться в герметичной упаковке при —20 °С достаточно долго.

2.5.2.1. Методика [123]. Пептид 89—169 основного белка бычьего миелина (1—7 мкмоль/мл) инкубируют с BNPS-скатолом (17 мкмоль/мл) в 75%-ной уксусной кислоте при 37 °С в течение 24 ч. Затем избыток реагента и побочные продукты реакции отделяют повторной экстракцией этилацетатом, водный слой высушивают лиофильно. Очистку пептидных фрагментов ведут с помощью гель-фильтрации.

2.5.3. Расщепление по остатку триптофана

в системе ДМСО — галогеноводородные кислоты

Триптофансодержащие белки и пептиды можно расщепить избирательно смесью ДМСО и бромоводородной кислоты в уксусной кислоте. По выходу продуктов реакции этот метод сопоставим с расщеплением BNPS-скатолом, однако превосходит его по доступности реагентов и простоте реализации [51, 163]. Механизм реакции заключается в окислительном галогенирова-нии индольного ядра триптофана. Фактически при взаимодействии сульфоксида и галогеноводородной кислоты имеют место несколько равновесных реакций [уравнение (2.15)] с образова-

R,R2SO + 2НХ

R:R2SX+ + X

R,R2SX2 + Н20

!*

(2.15)

k,R2S + Х2

нием в качестве главного промежуточного продукта галогено-сульфониевого иона RiR2SX+ [14]. Галогенирование индольного ядра триптофана могут осуществлять все три промежуточные соединения: дигалогенид сульфида, галогенид галогеносульфо-ния и свободный галоген.

В то время как в смеси ДМСО —НС1 однозначно идет превращение триптофана в оксоиндолилаланин [162, 164], в ДМСО — НВг триптофан окисляется до диоксоиндолилаланина с одновременным образованием спиролактона [51]. Триптофансодержащие пептиды также окисляются смесью ДМСО — НВг до диоксоиндолилаланина, и только в этом случае окисление сопровождается расщеплением пептидной связи. Показано также, что оксоиндолилаланинпептиды, полученные при обработке смесью ДМСО—НС1, могут быть расщеплены при

HQ

2. ФРАГМЕНТАЦИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ ХИМИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ

последующей обработке смесью ДМСО—НВг. Этот факт свидетельствует об образовании в качестве промежуточного продукта реакции оксоиндола [162—164]. Для достижения оптимального выхода продуктов реакции рекомендуется проводить последовательную обработку белков смесями ДМСО — НС1, а затем ДМСО —НВг in situ. Непосредственное взаимодействие триптофансодержащих пептидов с ДМСО — НВг приводит к образованию в качестве промежуточного продукта 2-диметилсульфоиийтриптофана (58). По-види-

-HN-CH-CO- -HN-CH-CO-| I СН2 СНз /*Н+ ^ СНг

58

мому, образование такого соединения происходит в результате электрофилыюго замещения в положении 2 индолыюго ядра триптофана протонированиым ДМСО по аналогии с реакцией, наблюдающейся в ряду фенолов и их эфиров [63].

Реакция расщепления под действием смеси ДМСО — гало-геноводородная кислота идет избирательно по пептидной связи триптофана. При этом метионин окисляется до S-оксида, а цистеип — до цистина. На практике с целью защиты остатка тирозина в реакционную смесь добавляют немного фенола. Рекомендуется добавлять фенол и в 48%-ную НВг для связывания следов брома. Указанных мер вполне достаточно для полного сохранения тирозина [163], однако известно одно исключение, когда отмечалась его деструкция [57].

2.5.3.1. Расщепление по остатку триптофана путем обработки смесями ДМСО —НС1 и ДМСО— НВг [163]. Цитохром с (17 мг) и 20 мг фенола растворяют при 20 °С в смеси следующего состава: ледяная уксусная кислота (600 мкл) + 12 М НС1 (300 мкл), ДМСО (12 мкл). Спустя 30 мин в реакционную смесь добавляют 48%-ную НВг (100 мл) и ДМСО (25 мкл) и инкубируют при 20 °С в течение 30 мин. Затем прибавляют 2 мл воды и несколько раз экстрагируют этилацетатом (для удаления гема и продуктов его деструкции). Водную фазу частично упаривают в вакууме, остаток хро-матографируют в 10%-ной муравьиной кислоте на колонке (2X14 см) с сефадексом G-50 (супермелкий). Пептидные фрагменты цитохрома с элюируются в виде трех фракций. Первая фракция, которой предшествуют следы агрегированного белка, содержат апоцитохром с с модифицированным (в виде диоксоиндолилаланина) триптофаном-59. Вторая и третья фракции содержат соответственно фрагменты 1—59 и 60—104 (выход, ~60%, продуктов реакции определяют по результатам взвешивания после лиофилизации).

Фрагменты идентифицируют по аминокислотному составу гидролизата после гидролиза 3 М л-толуолсульфокислотой [1171. Выход аминокислот по результатам анализа соответствовал составу апоцитохрома с и его фрагмен-

2.5. РАСЩЕПЛЕНИЕ ПО ТРИПТОФАНУ

111

тов. Остатки метионина в положении 65 и 80 были окислены до метионин-S-оксида. Под действием реагента происходило полное отделение гема по аналогии с действием на цитохром с BNPS-скатола [50].

2.5.3.2. Расщепление по остатку триптофана под действием ДМСО — НС1 и BrCN [83]. Предварительно восстанавливают и алкилируют присутствующие в белке остатки цистина (цистеина). Для этой цели используют реагенты обычной классификации. Небольшое количество раствора образца, содержащего 2—3 нмоль белка, помещают в микропробирку объемом 1,5 мл от центрифуги Эппендорф и высушивают лиофильно. К сухому остатку прибавляют 4,9 мкл свежеприготовленного реагента (300 мкл ледяной уксусной кисло-ты+150 мкл 9 М НС1+40 мкл ДМСО) и инкубируют при 20 °С в течение 30 мин или при 4 °С в течение 2 ч. Затем реакционную смесь охлаждают на ледяной бане, добавляют 4,4 мкл охлажденного во льду 15 М (продажного) NH4OH (при этом возможно появление осадка белка) и 40 мкл раствора бромоциана (0,3 г/мл) в 5 М уксусной или 60%-ной муравьиной кислоте. Пробирку плотно закрывают и герметизируют с помощью пленки парафильм. Реакционную смесь инкубируют при 20 °С без доступа света в течение 12—15 ч или при 4 °С в течение 30 ч.

Расщепление по триптофану проходит почти количественно независимо от строения соседних аминокислот. Реакция не сопровождается расщеплением или модификацией других аминокислот. Проведению реакции не мешает присутствие небольших количеств солей, ионных детергентов или кумасси голубого.

2.5.4. Расщепление по остатку триптофана бромоцианом в гептафторомасляной кислоте

Взаимодействие бромоциана с остатком триптофана в белках может привести к расщеплению пептидной связи с участием карбоксильной группы. Умеренный выход продуктов реакции (~20%) наблюдался в случае ^-лактоглобулина [17] и глу-таматдегидрогеназы Neurospora crassa [210]. Было показано [134—136], что выход продуктов реакции возрастает при использовании большого избытка реагента (10 000 моль/моль белка) и более высокой кислотности среды (что достигается заменой продажной 70%-ной муравьиной кислоты па гептафто-ромасляную).

Недавно показано [51], что механизм реакции заключается в окислительном галогенировании ядра триптофана. Модельное соединение N-ацетилтриптофанамид под действием избытка бромоциана превращается в Ы-ацетил-5-бромодиоксоиидо-лиллактон (образуются также др

страница 16
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
куплю земельный участок с газом
sfm в красноярске
стойка для шин
электроприводы asto4 (s) с моментом вращения 4 нм

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(24.04.2017)