химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

епления пептидных связей, необходимо предельно ограничить время реакции.

12.11)

2.3. ЧАСТИЧНЫЙ КИСЛОТНЫЙ ГИДРОЛИЗ

95

2.3.3. Побочные реакции

Частичный кислотный гидролиз белка сопровождается рядом побочных реакций, таких, например, как дисульфидный обмен, образование дикетопиперазинов, циклизация N-концевого глу-тамина в пирролидонкарбоновую кислоту, а—^-миграция остатков аспарагиновой кислоты, гидролиз аспарагина и глу-тамина с образованием карбоновых кислот, частичная деструкция остатков триптофана.

Реакция дисульфидного обмена [уравнение (2.12)] идет в сильнокислой среде в основном по механизму, включающему образование сульфиний-ионов RS+ [156, 212]. Фактически, при

R^SS-Rj + Ra-SS—R2 ^ 2Rt-SS-R2 (2.12)

гидролизе инсулина в концентрированной НС1 получают избыточное количество цистинсодержащих пептидов (по сравнению с числом S—S-связей) [156]. Следовательно, реакция дисульфидного обмена при частичном кислотном гидролизе существенно усложняет задачу локализации дисульфидных связей.

Если при частичном гидролизе белка образуются дипеп-тиды, вполне возможно, что они не будут соответствовать природному фрагменту из-за инверсии порядка аминокислот. Причиной инверсии является циклизация дипептидов в дикето-пиперазины, легко протекающая в разбавленных кислотах при комнатной температуре [уравнение (2.13)]. Гидролиз этих

*i R,

| I СН СН

H2N^ *Ч° -н;о^ Nfi >0

NH ~^о" ср NH -** HjNCHCO—NHCHCOOH

ноос—сн СН^ R2 Rj

К2 *г (2.13)

дипептид дикетопи.перазин

циклических соединений может привести как к исходному, так и к изомерному дипептиду с обращенной последовательностью аминокислот. Дикетопиперазины менее устойчивы в условиях кислотного гидролиза по сравнению с соответствующими дипеп-тидами. Инверсия аминокислотной последовательности в 0,1 М НС1 наглядно показана на примере глицилвалина [158].

Реакция а,р-транспептидации остатка аспарагиновой кислоты идет в кислой среде через промежуточное образование сукцинимидного производного [уравнение (2.14)] [128, 185]. Образующееся р-аспартилпроизводное придает пептидной связи устойчивость к гидролизу экзопептидазами, например лейцина-

96

2. ФРАГМЕНТАЦИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ ХИМИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ

минопептидазой и карбоксипептидазами. Более того, (5-аспар-тилимид блокирует секвенирование по Эдману на стадии циклизации.

^NH-CH-CO-NH- ^nh-CH-C04 ^NH-CH-COOH

' I I

CH2 * I CH2-CO—NH-'

COOH CH*~co

ot-аспартилпелтид o> р-аспзртшшептид р-аспартилпептид

(2.14)

В достаточно мягких условиях идет циклизация N-концевого остатка глутамина (18) в пирролидонкарбоновую кислоту (19)

H.N СН CONH~ чн NH-СН—CONHw

сн2 с ^сн2

H2NOC—СН2 °" СН2

18 19

[77, 177]. Поэтому пептиды с N-концевым глутамином дают отрицательную реакцию с нингидрином и не могут быть секве-нированы. Аналогичным образом может циклизоваться остаток глутаминовой кислоты, но в более жестких условиях. Относительно отщепления N-концевой пирролидонкарбоновой кислоты -см. разд. 1.6.1.

2.4. Расщепление по остатку метионина

2.4.1. Бромоциан

Расщепление пептидной связи по карбоксильной группе метионина основано на взаимодействии бромоциана с тиоэфирной группой с образованием гомосерина, гомосеринлактона и метил-тиоцианата [68].

Цианогруппа реагента злектрофильно атакует атом серы, образуя промежуточную цианосульфониевую соль (20). Нуклео-фильная атака кислородом карбонильной группы метионина у-углеродного атома цианосульфониевой соли приводит к освобождению метилтиоцианата и образованию иминолактона (21). Промежуточный иминолактон гидролизуется с образованием пептидилгомосеринлактона (22) и соответствующего пептидил-гомосерина, а также «аминопептида» (23) [67—69].

После первоначального успешного применения бромоциана при исследовании рибонуклеазы [69] эта реакция получила самое широкое применение [67, 181]. В оптимальных условиях бромоциан расщепляет пептидную связь метионина многих

2.4. РАСЩЕПЛЕНИЕ ПО МЕТИОНИНУ

97

^nh

О

II

СН С- NH

I

СН2

i

S-~^C=N СН3 ^Br

сн

к

о

II

^NH

сн с

сн2 сн,

+ S—cn

i

СНз 20

NH

Вг

сн r

О

Cw

NH

r

I

CH

О

II

о

^NH—СН —С

н2с

\ О

сн2

21

+

CH3SCN

Вг

^nh- сн -с

I О + h2n сн

I / |

н2с- сн2 r

о

II

22

23

Н;0

NH~СН — СООН

СН2 СН2 ОН

белков, причем часто с количественным выходом. Наиболее длинный полипептид, который удалось расщепить с помощью бромоциана, [3-галактозидаза Е. coli, включающая 1021 аминокислотный остаток [55]. Метод удобен в практическом отношении, поскольку реагент и побочные продукты реакции летучи и легко удаляются при лиофилизации. Поскольку метионин принадлежит к относительно редким аминокислотам, реакция расщепления бромоцианом позволяет получить крупные фрагменты, которые удобны как объекты для автоматического секвенирования.

Все получаемые фрагменты имеют на С-конце гомосерин-лактон, исключение составляет С-концевой пептид белка. При аминокислотном анализе гомосеринлактон злюируется в области основных аминокислот, обычно между аммиаком и аргинином. Гомосерин элюируется вместе с глутаминовой кислотой, однако известны условия, позволяющие элюировать их раздельно [67]. Гомосеринлактон гидролизуют в гомосерин путем обработки 0,1 М NaOH в течение 1 ч [172] или в буфере пиридин — уксусная кислота (рН 6,5) при 105°С в течение 1 ч

И-

7—703

98 2. ФРАГМЕНТАЦИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ ХИМИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ

По данным количественного определения гомосерина [67] и метилтиоцианата [90] можно сделать ошибочный вывод

н S CN

I

си,

о

II

сн2 о

¦~ЧГ —NH—СН- С—NH~

24

сн2 о сн.

ХН CONH-

NH 25

О

II

\-^С

СН

сн2

NH СН --C--NH^ 27

О

I

сн2 сн2

i

—¦СО H3N CH CONH-^

26

О-пептидилгомосерил-пептид

СН2ОН

о сн2

II I

NH—СН— СООН + H3N^ 28

N-аминоацилгомосерин

относительно степени прохождения реакции расщепления. Показано, что гомосерин может образоваться совсем по иному механизму, без расщепления связей метионина. Принято считать, что побочная реакция идет через образование шестичлен-ного цикла (25->26) и может конкурировать с реакцией образования пятичленного иминолактона (27~>28) [22].

После нейтрализации реакционной среды О-пептидилгруп-па мигрирует к атому азота гомосерина (разд. 2.3.2). Степень протекания этой побочной реакции, по всей видимости, варьирует в зависимости от природы двух аминокислотных остатков, граничащих с метиопипом.

В ряде случаев низкий выход реакции расщепления бромо-цианом объясняется присутствием наиболее устойчивых фрагментов Met-Thr или Met-Ser [167, 191], причем промежуточный иминолактон атакуется соседним гидроксилом треонина или серина с образованием гомосерил-О-треонил- или гомосерил-О-серилпептидов (29^-33); бициклическая структура (30) распа-

2.4. РАСЩЕПЛЕНИЕ ПО МЕТИОНИНУ

99

дается с образованием боковой цепи гомосерина (31) и с раскрытием цикла, давая соединения (32) или (33) со сложно-эфирной или пептидной связью соответственно.

Met-Thr-белок

СН3 CHj

НО -СН О — - СН

I I I

-~NH—СН—C-NH- СН -COw wNH СН С NH- СН -СО^--

i

О

сн2 >н3

сн2 jy сн2

29 30

СН,

о—ен—СО^

I I

л NH - СН—С +NHj

I II

сн2 о

он

32

CH,

о но-сн

II :

-wNH--СН—С -NH -СН -COw 31 I

сн2 сн2 он

33

Показано, что расщепление фрагментов Met-Thr или Met-Ser целесообразно проводить в водной трифтороуксусной кислоте (ТФУ). Как сильная кислота ТФУ может препятствовать протеканию побочной реакции благодаря протонированию гидроксильных групп и иминолактона [167, 191].

Пептидные связи метионин-Б-оксида и метионин-5,8-диокси-да не расщепляются бромоцианом [67]. Недавно появилось сообщение [51] о том, что при большом избытке (1000 экв.) бромоциана в 70%-ной муравьиной кислоте метионин окисляется до метионин-Б-оксида. Это наблюдение позволяет объяснить устойчивость пептидных связей метионина при большом избытке реагента [134, 135]. Известно, что в присутствии бромоциана идет окисление цистеина до цистина [56] и с меньшей

7*

100 2. ФРАГМЕНТАЦИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ ХИМИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ

скоростью до цистеиновой кислоты [67]. Кроме того, при избытке бромоциана идет бромирование остатков тирозина [51] и расщепление пептидной связи триптофана (разд. 2.4.2).

Реакцию проводят в 0,1 М соляной, водных муравьиной или трифтороуксусной кислоте. В настоящее время как растворитель наиболее часто применяют 70%-ную муравьиную кислоту. В кислой среде е-аминогрупны и другие основные группировки находятся в протонированной форме, благодаря чему исключается их взаимодействие с бромоцианом. Кроме того, в водной муравьиной кислоте как сильном денатурирующем агенте остатки метионина становятся более «экспонированными», т. е. более доступными для реагента.

Реакция с бромоцианом находит и иное применение. Пептидные фрагменты, полученные при расщеплении бромоцианом и несущие С-концевой гомосеринлактон, можно вводить в реакцию конденсации (с высоким выходом) с аминогруппами полимеров (34-^36). Этот метод позволяет избирательно фиксировать фрагменты через С-концевой аминокислотный остаток на нерастворимом носителе с целью твердофазного секвенирования [86].

полимер—NH2 + ОС-СН—NH—белок

34 35

ОН

I

СН,

сн,

полимер- -NH—CO—CH—NH—белок 36

Полагают, что фрагменты 1—65 и 66—104 цитохрома с сердца лошади, полученные расщеплением бромоцианом в водной среде, способны к самосборке с реконструкцией пептидной связи [34]. Аналогичным образом самопроизвольно происходит конденсация фрагментов (1—52 и 53—58) панкреатического ингибитора трипсина [41]. Иными словами, циклическая структура С-концевого гомосеринлактона находится в достаточно активированном состоянии, чтобы в мягких условиях вступать в реакцию аминолиза с а-аминогруппой N-концевой аминокислоты. Благодаря этому удается осуществить синтез цитохрома с и трипсинового ингибитора из соответствующих фрагмен-

2.5. РАСЩЕПЛЕНИЕ ПО ТРИПТОФАНУ

101

тов [173]. Другая область применения реакции метионина с бромоцианом удивительным образом связана с генноинженер-ным синтезом некоторых гормонов. С помощью этой реакции ведут расщепление гибридного белка «гал-Ме1;-соматотропина» из Е. coli с образованием белка-носителя ^-галактозидазы и целевого тетрадекапептида соматотропина [93].

2.4.1.1. Методика. Навеску белка растворяют (10—20 мг/мл) в 70%-ной муравьиной кислоте и добавляют твердый бромоциан (2 мг/мг белка или 20— 100-мольный избыток в расчете на метионин). Инкубацию ведут при комнатной температуре без доступа света в течение 18—20 ч. По завершении реакции реакционную смесь разбавляют 5—10 объемами воды и высушивают лиофильно. Продукты реакции разделяют гель-фильтрацией. Продолжительность реакции может быть существенно меньше. Например, 0,5 мкмоль пептида/мл обрабатывали бромоцианом (5 мг/мл) при комнатной температуре в течение 4 ч [101, 200].

2.4.2. Другие реагенты

Расщепить пептиды по остатку метионина можно с помощью агентов, алкилирующих тиоэфирную группу по механизму реакции, аналогичному расщеплению бромоцианом. Наиболее эффективным реагентом оказался иодоацетамид [109, ПО]. При обработке апокаталазы этиленимином идет реакция присоединения по тиоэфирной группе метионина с образованием амино-этилсульфониевой соли с последующим расщеплением пептидной связи [166]. В сочетании с методом диагонального электрофореза эту реакцию применяли для идентификации и выделения пептидов, содержащих остатки метионина [187, 188].

На модельных пептидах показано, что расщепление по ме-тионину идет с высоким выходом под действием фтороводорода [112, 133]. Реакция сопровождается N-^O-ацильной миграцией по остаткам серина и треонина (разд. 2.3.2). Из-за этой побочной реакции метод расщепления с помощью HF не находит применения в химии белка.

2.5. Расщепление по остатку триптофана

Метод селективного расщепления пептидных связей остатка триптофана основан на высокой реакционной способности ин-дольного ядра. При этом благодаря низкому содержанию в белках триптофана должны образоваться несколько крупных фрагментов, удобных для секвенирования. Однако, несмотря на то что за годы поисков были найдены подходящие реагенты и методики, лишь немногие из них нашли практическое применение [47, 181]. Далее подробно рассматриваются наиболее полезные и часто применяемые на практике методики. Относительно остальных методов расщепления по триптофану будут сделаны лишь короткие комментарии.

102 2. ФРАГМЕНТАЦИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ ХИМИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ

2.5.1. Окислительное галогенирование

Окислительное галогенирование индольного ядра остатка триптофана N-бромосукцинимидом (NBS) было впервые предложено как метод модификации и расщепления триптофилпел-тидной связи. Из других бромирующих агентов, которые использовались для этих целей, следует упомянуть N-бромо-ацетамид, N-бромофталимид и бром [47, 137, 148, 181, 209].

Главный недостаток расщепления белков по карбоксильной группе триптофана с помощью бромосукцинимида заключается в низком выходе фрагментов, который редко превышает 50%, а иногда составляет даже 5%. Кроме того, расщепление но триптофану сопровождается побочными реакциями. На практике благодаря высокой реакционной способности N-бромосук-цинимида может идти модификация и расщепление пептидных связей не только остатков триптофана, но и остатков тирозина (разд. 2.6.1) и гистидина (разд. 2.8.3). Однако расщепление по тирозину можно исключить путем О-ацилирования фенольного гидроксила [169—171]. Расщепление по гистидину также можно свести к минимуму, поскольку эта реакция идет только при нагревании. В ходе реакции метионин в значительной степени окисляется до метионин-Б^-диоксида, а цистеин и цистин до цистеиновой кислоты. В 8 М мочевине N-бромосукцинимид расщепляет только связи триптофана, в то время как тирозин не затрагивается [64]. Из-за недостатков, свойственных методу с применением N-бромосукцинимида, была изучена возможность применения других галогенирующих реагентов.

Расщепление с помощью N-бромосукцинимида проводят в кислой среде при достаточном избытке реагента в расчете на серусодержащие аминокислоты, тирозин и гистидип. При расщеплении простых триптофансодержащих пептидов на 1 моль пептида в реакции расходуется 2—3 моля N-бромосукцинимида. Исследование взаимодействия бромосукцинимида с 3-индолами и простыми производными триптофана [209], а также строения некоторых промежуточных продуктов реакции [51, 162, 163] позволило предложить наиболее вероятный механизм расщепления связи по триптофану через окислительное галогенирование (см. последовательность реакций 37-ПЗ).

Как следует из предлагаемой схемы реакций, в превращениях участвуют 2 экв. электрофильного галогена. Благодаря своей высокой реакционной способности N-бромосукцинимит, галогенирует бензольное кольцо тирозина в положение 5 [137]. По-видимому, первым промежуточным продуктом реакции является 3-галогеноиндоленин (38), который затем в результате гидролиза и элиминирования переходит в оксоиндол (39). Далее оксоиндол (39) при взаимодействии со вторым эквивален-

2.5. РАСЩЕПЛЕНИЕ ПО ТРИПТОФАНУ

103

том положительно заряженного галогена

страница 15
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
курсы ексель на пушкинской москва
декоративные таблички с надписями
цена на концерт кристины орбакайте 2016
30040-138

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(03.12.2016)