химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

и инкубируют в течение 2 ч. Реакционную смесь диализуют против 100 объемов 1-%ного NH4HCO3, затем против дистиллированной воды и высушивают лиофильпо.

Методика 1. Алкилирование с помощью 4-винилпиридина [92]. Навеску белка (300—500 мг) растворяют под азотом в 20—30 мл трис-НС1-буфера (рН 7,5), содержащего 8 М мочевину, добавляют 4-винилпиридин (20 молей на 1 «мол.» SH-группы) и инкубируют при перемешивании в течение 2—3 ч. Затем подкисляют ледяной уксусной кислотой до рН 3, диализуют против 0,01 М уксусной кислоты и высушивают лиофильно.

2.2.2.2. Алкилирование с помощью 4-винилпиридина [25, 60]. Реакция идет согласно уравнению (2.6). С помощью 4-винилпиридина в полипептидную цепь вводят полярную группировку, которая повышает растворимость белка и способствует его последующей очистке. Модифицированный остаток цистеина устойчив в условиях кислотного гидролиза, имеет характерное

88 2. ФРАГМЕНТАЦИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ ХИМИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ

поглощение при 260 нм, его ФТГ-производное легко идентифицируется при секвеиировании [75].

^ —* белок —S-- СН2- -СН2 ¦ (2.6)

Методика 1. Алкилирование с помощью А-винилпиридина [92]. Навескч белка (300—500 мг) растворяют под азотом в 20—30 мл трис-НС1-буфера (рН 7,5), содержащего 8 М мочевину, добавляют 4-винилпиридин (20 молей на 1 «моль» SH-группы) и инкубируют при перемешивании в течение 2—3 ч. Затем подкисляют ледяной уксусной кислотой до рЫ 3, диализуют против 0,01 М уксусной кислоты и высушивают лиофильно.

Методика 2. Восстановление дитиотреитом и алкирование 4-винилпириди-ном [75]. Свиной трипсин (20 мг) растворяют в 1 мл буфера следующего состава (рН 7,6): 0,13 М трис-НС1+6 М гуанидин-IICI + O", 1 мг ЭДТА. Прибавляют ДТТ (20 молей на 1 «моль» S—S-группы), инкубируют при 20 °С з течение 3 ч. Добавляют 4-винилшфидип в количестве 3 моль/моль ДТТ, ппкубируют в течение 90 мин. Реакционную смесь подкисляют 88%-ной муравьиной кислотой до рН 2,0 и фракционируют с помощью гель-фильтрации ,:а сефадексе G-75 в 9%-ной муравьиной кислоте. Получают три фракции, . оответствующие цепи ^-трипсина и двум фрагментам а-трнпенпа.

2.2.2.3. Другие SH-алкилирующие- реагенты. С целью введения в полипептидную цепь заряженных группировок предложено алкилировать остатки цистеина 2-бромоэтансульфонатом (6) [129], 1,3-пропансультоном (7) [151, 153] и 2-бромоэтилтриме-

СН2

/ \ СНз

сн сн i

Br -СН2СН: SO;Na+ \ 2 2 ВгС Н:СН:—* N—СН,Вг

so, -о

I

СНз 8

тиламмонийбромидом (8) [94]. Поскольку эти группировки сохраняют заряд в широком диапазоне рН, полученные производные можно фракционировать с помощью электрофоретиче-ских методов.

Методика. Восстановление и модификация 1,3-пропансультоном [151]. Рибонуклеазу (64 мг, 5 мкмоль) растворяют в 7,5 мл буфера следующего состава: 0,1 М трис-HCI (рН 8,2)+н-пропанол (2: 1)+7 М мочевина; раствор деаэрируют и насыщают азотом. Затем прибавляют трибутилфосфин (22— 40 мкмоль, 1,1—2-кратный избыток) в виде 5%-ного раствора в пропаноле и 320 мкл (80 мкмоль) 250 мМ раствора 1,3-пропаисультона в водном пропаноле (1:1), инкубируют при 20 °С в течение 16 ч. Реакционную смесь подкисляют уксусной кислотой, трижды диализуют при пониженной температуре против 0,1%-ной уксусной кислоты и высушивают лиофильно.

2.2.2.4. Обратимая защита тиольной группы. Иногда возникает необходимость обратимой защиты тиольной группы, т. е. введения защитной группы, которая впоследствии может быть уда-

2.2. РАСЩЕПЛЕНИЕ ДИСУЛЬФИДНЫХ СВЯЗЕЙ

89

лена. Обратимую защиту остатков цистеина в белках осуществляют путем образования смешанных дисульфидов, которые легко расщепляются при восстановлении. К классу смешанных (несимметричных) дисульфидов относятся продукты реакции цистеина с арилсульфенил-галогенидами [46, 48]. 2-Нитрофе-иилсульфеиилхлорид реагирует в водной уксусной кислоте с остатком цистеина, образуя смешанный дисульфид (9), а также с остатком триптофана с образованием тиоэфира (10). Азобеи-

^NH СН СО^

I

с ГЛ

—NH СН СО—

I

сн2

S S

NO,

о2к

Н

10

зол-2-сульфенилбромид взаимодействует с SH-группой, согласно уравнению (2.7), и не реагирует с триптофаном. Отсутствие реакции с индольным циклом триптофана объясняется особенностями строения иона 2-фенилбензо-1-тио-2,3-диазония (11).

О

N N

SH

-ГЛ s s

сн 7---- I , <2Л>

—NH-CH СО— + <: VN wNH-CH-CO-^

Смешанные алкиларилдисульфиды образуются при взаимодействии остатка цистеина с 5,5/-дитиобис(2-нитробензойной) кислотой (12) (ДТНБ), называемой реактивом Эллмана [43], согласно уравнению (2.8). ДТНБ имеет более высокий по сравнению с алифатическими дисульфидами окислительно-восстановительный потенциал, поэтому при взаимодействии с алифатическими тиолами идет реакция обмена с образованием смешанного дисульфида и окрашенного иона 2-нитро-5-тиобензоата (14). Реактив Эллмана находит широкое применение для количественного определения остатков цистеина в белках [72].

90

2. ФРАГМЕНТАЦИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ ХИМИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ

Показано, что алкилалкантиосульфонат как специфический реагент на SH-группы также образует смешанные дисульфиды

12

—> белок—S- S

(2.8)

> NO: СООН

SH

СООН

13

NO, 14

согласно уравнению (2.9). Реакция идет с высокой скоростью в мягких условиях

белок-SII + R-S-SCVR —> 6c-iok-S-S-R + R-S02H (2.9)

и не требует избытка реагента [104, 176]. К наиболее известным реагентам этого типа относится метилметантиолсульфо-нат, с помощью которого в тиолосодержащий белок вводят CH3S-rpynny.

2.2.3. Расщепление S—S-групп путем окисления

Окислительное расщепление S—S-групп в белках обычно проводят надмуравьиной кислотой. При этом остатки цистеина и цистина с выходом >90% превращаются в цистеиновую кислоту (15). Цистеиновая кислота стабильна при кислотном гидролизе; при анализе на аминокислотном анализаторе элюируется непосредственно перед аспарагиновой кислотой [180]. Этот

so3H

wNH- СН СО 15

СН,

I

so2

I

-NHCHCO— 16

HCO-NH

СО

i

СН2

I

v NH-CH -СО-^ 17

прием применяется для определения в белках суммарного содержания цистеина и цистина. При окислении метионин превращается в S—S-диоксид (16), триптофан — в N-формил-кинуренин (17) и неидентифицированные продукты окисления

2.2. РАСЩЕПЛЕНИЕ ДИСУЛЬФИДНЫХ СВЯЗЕЙ

91

[7, 192], а тирозин — частично в галогенпроизводные [77, 160]. Попытки найти условия избирательного окисления цистина и цистеина с целью свести к минимуму побочные реакции других аминокислот или по крайней мере добиться образования хорошо идентифицируемых продуктов окисления оказались безуспешными. Впервые окисление надмуравьиной кислотой применялось при изучении инсулина [157] и рибонуклеазы [77, 84].

2.2.3.1. Окисление надмуравьиной кислотой. Для получения надмуравьиной кислоты смешивают 99%-ную муравьиную кислоту и 30%-ный пероксид водорода в соотношении 95:5 и оставляют стоять в закрытом сосуде при комнатной температуре в течение 2 ч. К этому времени содержание надмуравьиной кислоты в реакционной смеси достигает максимального, а затем постепенно снижается. Навеску белка растворяют в 99%-иой муравьиной кислоте, добавляют метанол (до 20%-ной концентрации), охлаждают до —5°С и добавляют надмуравьи-ную кислоту (1 мл на 5 мг белка) в соотношении 2: 1. Окончательная концентрация белка в реакционной смеси составляет — 0,5%. Инкубируют при —5^-—10°С в течение 2—3 ч, разбавляют водой и высушивают лиофильно. Белок можно выделите из раствора осаждением трихлороуксусноп кислотой или оога-ническим растворителем. Реакционную смесь можно разбавить вдвое охлажденной водой и диализовать на холоду против воды (дважды) и 1 мМ 2-меркаптоэтанола, а затем высушить лиофильно. См. также разд. 1.5.1.1.

2.2.4. Реакция с сульфитом

При действии на дисульфиды сульфит-иона образуются S-суль-фосоединеиия и тиолы [уравнение (2.10)]. Тиолы вновь окисляются до дисульфидов, которые в итоге полностью переходят в S-сульфонаты [26, 31, 116].

RSSR+sor^RS" + RSS03

Го]

Сульфитолиз применяют в качестве мягкого метода расщепления дисульфидных связей в белках. S-сульфопротеины стабильны в кислой и нейтральной области рН, хорошо растворяются в воде. S-сульфогруппа легко восстанавливается тиолами, поэтому эту реакцию применяют с целью обратимого блокирования SH-групп цистеина при пептидном синтезе [16, 102, 150].

Известный метод определения полуцистина в белковых гид-ролизатах в виде S-сульфоцистеина основан на том, что цистеин или цистин восстанавливают дитиотреитом, а затем обраба-

92 2. ФРАГМЕНТАЦИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ ХИМИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ

Таблица 2.1. Примеры частичного кислотного гидролиза белков

Белок Условия гидролиза Литература

Инсулин 12 н. ИС1, 37 °С, 3 сут 159

Лизоцим 12 н. НО, 37 °С, 7 сут 190

Трипсин 5,7 н. НС1, 100 °С, 20—30 мин 128

Фосфоглюкомутаза 2 п. HCI, 100 °С, 30 мин 124

Рибонуклеаза, инсулин, 0,03 н. НС1, 105 °С, 4—48 ч 65, 168

глюка гон

тывают избытком тетратионата натрия Na2S406 [91, 1181. Первоначально предполагалось [139], что взаимодействие SH-rpynn с тетратионатом приводит к образованию S-сульфосульфенил-производного, а не S-сульфоцистеипа. Однако оказалось [91], что в условиях эксперимента со свободным цистеипом образуется исключительно S-сульфоцистеин, который на аминокислотном анализаторе элюируется рядом с цистеиновой кислотой [118]. Окислительный сульфитолиз рассматривается также в разд. 1.5.1.2.

7.3. Частичный кислотный гидролиз

Частичный кислотный гидролиз пептидных связей проводят в более мягких условиях по сравнению с исчерпывающим гидролизом до свободных аминокислот [101]. С целью фрагментации полипептидных цепей применяются два варианта методики: частичный гидролиз концентрированной соляной кислотой и гидролиз разбавленными кислотами. Относительная скорость гидролиза пептидной связи зависит от стерического и электростатического факторов. Показано, что наиболее устойчивы пептидные связи валина и лейцина [186], в особенности в дипепти-дах, образованных двумя разветвленными аминокислотами (например, Val-Ile и Пе-Ие). Можно полагать, что положительно заряженные основные группы будут отталкивать ион водорода, и именно это объясняет устойчивость дипептидов, накапливающихся в реакционной смеси к концу гидролиза.

Наиболее часто применяется соляная кислота, в специальных случаях — уксусная кислота в смеси с другими кислотами. Условия частичного кислотного гидролиза белков описаны в табл. 2.1.

Кислотный гидролиз идет не очень специфично с образованием гетерогенной смеси фрагментов. Например, при гидролизе А- и В-цепей инсулина [159] и лизоцима [190] было получено множество ди- и трипептидов, которые удалось выделить и охарактеризовать. Хотя секвенирование небольших пептидов не

2.3. ЧАСТИЧНЫЙ КИСЛОТНЫЙ ГИДРОЛИЗ

93

составляет проблемы (при условии, что их удалось выделить), частичный кислотный гидролиз редко используется на практике, поскольку в настоящее время имеются быстрые и достоверные методы секвенирования довольно крупных фрагментов.

2.3.1. Расщепление связи Asp-Pro

Пептидная связь Asp-Pro особенно лабильна в условиях мягкого кислотного гидролиза ,[58, 73, 97, 108]. Избирательное расщепление может идти в кислой среде при гидролизе пепсином, при обработке белка раствором бромоциана в 70%-ной муравьиной кислоте или в процессе очистки пептидов гель-фильтрацией в водной уксусной или муравьиной кислоте. Частичный гидролиз связи Asp-Pro наблюдался, в частности, при обработке глутаматдегидрогепазы бромоциапом в 70%-пой муравьиной кислоте [140]; в этой же работе обсуждается вероятный механизм кислотного гидролиза пептидной связи Asp-Pro.

К сожалению, связь Asp-Pro встречается в белках достаточно редко; тем не менее этот прием полезен, поскольку позволяет получать относительно крупные фрагменты, удобные для автоматического секвенирования.

2.3.1.1. Методика [130]. S-Пиридилэтилпроизводное (полученное по реакции с 4-вннилпирпднном) у-цепи фетального гемоглобина (51 мг) растворяют в 2 мл 70%-ной муравьиной кислоты, содержащей 7 М гуанидин-HCl, и инкубируют при 40 °С в течение 24 ч. Затем в реакционную смесь добавляют 2 мл охлажденной деиоиизированной воды и незамедлительно хроматогра-фируют и 9%-пой уксусной кислоте на колонке (2X95 см) с сефадексом G-75 (супермелкий). С-Концевой фрагмент (остатки 100—146) получают после лиофильного высушивания соответствующих фракций и вторичного хро-матографирования на колонке (2X95 см) с сефадексом G-50 (супермелкий) также в 9%-ной муравьиной кислоте.

2.3.2. N—^О-ацильная миграция

Пептидные связи с участием аминогрупп серина и треонина также довольно легко гидролизуются в кислой среде при комнатной температуре; в особенности чувствительны к гидролизу серинсодержащие пептиды [95]. По-видимому, механизм гидролиза включает миграцию ацильной группы и последующий гидролиз сложноэфирной связи [уравнение (2.11)]. N^O-ацильная миграция идет в концентрированных безводных кислотах, таких, как серная, фосфорная, фтороводородная или муравьиная. Классическим реагентом, практически исключающим неспецифический гидролиз, является концентрированная!

94

2. ФРАГМЕНТАЦИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ ХИМИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ

серная кислота [40, 42]. Показано, например, что инсулин после обработки серной кислотой сохраняет биологическую активность [62]. Однако при этом может идти частичное сульфирование тирозина и частичное разрушение триптофана.

н н

"о 1 +

^NHCH —С —NHCHCTW ^NHCH- С—NHCHCO^

| 1 ! i I I

К О СН2 К О- СН,

I

ОН

^NHCH—СО H2NCHCO— wNHCHCOOH + H,NCHCO—

II! о

R О-—СНа СН2

ОН

При фрагментации по остаткам серина и треонина с помощью реакции N-^O-ацилыюй миграции особого внимания заслуживает избирательный гидролиз сложноэфирной связи («О-пептидной» связи) по серину и треонину. В принципе гидролиз сложноэфирной связи можно проводить как в кислой, так и в основной среде. Поскольку, однако, в основной среде гидролиз приводит к образованию исходного ациламида, необходимо предварительно защитить аминогруппы путем ацилирования. Наличие защиты позволит исключить обратную реакцию O-^N-ацильной миграции и тем самым обеспечить высокий выход продуктов реакции. Обратимость реакции миграции в основной среде объясняется образованием циклического гидро-ксиоксазолидина [95],

N-ацилирование проводят в присутствии большого избытка уксусного или муравьиного ангидрида. Для последующего сек-венирования пептидных фрагментов необходимо провести гидролиз ацильных групп. Формильную защиту снимают кратковременной обработкой НС1 в метаноле при комнатной температуре, более устойчивые ацетильные группы отщепляют 0,01 М КОН. Из других методов расщепления «О-пептидных» связей следует упомянуть реакцию с гидроксиламином или гидразином с образованием гидроксамовых кислот или гидра-зидов N-концевых партнеров гидроксиаминокислот (серина и треонина); для этих целей применяли также 1М пиперидин [64]. Относительно определения ацетильных и формильных групп см. разд. 8.13.

Гидролиз сложноэфирных связей проводят также в 6М НС1; однако, поскольку с увеличением времени гидролиза возрастает вероятность неспецифического расщ

страница 14
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
кража п.в ч.2 ст. 158 ук ha какой тяжести преступление
купить билет концерт филиппа киркорова в кремле
шумоглушители sg
клапан siemens vxf22.50-40

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(17.01.2017)