химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

pp. 137—162.

173. Thomas J. O., In: Techniques in Protein and Enzyme Biochemistry В 106, Elscvicr/North-IIolland, Shannon, 1978, pp. 1—22.

174. Thompson E. O. P., O'Donnell I. Aust. J. Biol. Sci., 19, 1139—1151 (1966).

175. Tuszynski G. P., Datnsky С. H., Fuhrer J. P.t Warren L., Anal. Biochem., 83, 119—129 (1977).

176. Ui N.t Biochim. Biophys. Acta., 229, 567—581 (1971).

177. Van Holde K. In: The Proteins, I, 3rd edn., Neurath H., Hill R. L. (Eds.), Academic Press, New York, 1975, pp. 225—291.

178. Vinograd /. R., Hutchinson W. D., Schroeder W. A., J. Am. Chem. Soc, 81, 3168—3169 (1959).

179. Von Hippel P. #., Schleich 7\, In: Structure and Stability of Biological Macromolecules, Timasheff S. N., Fasman G. D. (Eds.), Marcel Dekker, New York, 1969, pp. 417—454.

ЛИТЕРАТУРА

81

180. Walker J. E., Auffret A. D>, Came A. F., Naughton Af. A., Runswick M. Л, In: Methods in Peptide and Protein Sequence Analysis, Proc. Third Internal. Conf., Birr C. (Ed.), Elsevier/North-Holland, Amsterdam, New York, Oxford, 1980, pp. 257—265.

181. Ward C. W., Dopheide T. A. A., Virology, 103, 37—53 (1980).

182. Weber K., Osborn AL, J. Biol. Chem., 244, 4406—4412 (1969).

183. Weber K., Osborn Af., In: The Proteins, I, 3rd edn., Neurath IT., Hill R. L (Eds.), Academic Press, New York, 1975, pp. 179^-223.

184. Wieland F., Renner L„ Verfurth C, Ltjnen F., Eur. J. Biochem., 94, 189— 197 (1979).

185. Wright D. J., Boulter ?>., Biochem. J., 141, 413—418 (1974).

186. Yamato S., Murachi Т., Eur, J. Biochem., 93, 189—195 (1979).

6—703

Глава 2

ФРАГМЕНТАЦИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ ХИМИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ

А. ФОНТАНА (A. FONTANA, Institute of Organic Chemistry (Biopolymer Research Centre, C.N.R.), University of Padova, Padova, Italy), Э. ГРОСС (E. GROSS, National Institute of Child Health and Human Development, Endocrinology and Reproduction Research Branch, Section on Molecular Structure, Bethesda, Maryland 20205, U.S.A.)

2.1. Введение

Как правило, первичную структуру белка не удается установить путем последовательного секвенирования всей полипептидной цепи. Для этого приходится анализировать фрагменты, полученные избирательным расщеплением полипептидной цепи химическим или ферментативным методом. Следовательно, стадия фрагментации полипептидной цепи на низкомолекулярные пептиды с целью последующего структурного анализа — это один из важнейших этапов в определении ковалентной (первичной) структуры белка.

В этой главе рассматриваются способы фрагментации полипептидных цепей химическими методами; вопросам ферментативного гидролиза посвящены гл. 3 и 10.

В основе химических методов расщепления лежит способность модифицированных химическим путем аминокислотных остатков активировать полипептидные связи прилегающих звеньев цепи [20, 21]. В химии белка многие годы используется расщепление по остаткам некоторых аминокислот. Приемлемый на практике способ избирательного химического расщепления полииептидных цепей должен удовлетворять двум требованиям: обладать высокой избирательностью и обеспечивать высокий выход. В идеальном случае при расщеплении отдельной пептидной связи не должно происходить побочных реакций. Однако на практике известные методы химического расщепления не лишены недостатков; прежде всего к ним относятся низкий выход продуктов реакции и нежелательные побочные реакции.

Одно из основных требований, предъявляемых к методике фрагментации, касается высокой специфичности, т. е. речь идет о разрыве лишь немногих полипептидных связей, в результате чего образуется смесь пептидов, которую довольно легко разделить. Принципиально имеется возможность определения достаточно протяженной последовательности аминокислот путем автоматического секвенирования, однако гораздо практичнее получить небольшой набор крупных фрагментов, которые пос-

2.2, РАСЩЕПЛЕНИЕ ДИСУЛЬФИДНЫХ СВЯЗЕЙ

83

ле разделения послужат более удобными объектами автоматического секвенирования. Потенциальными мишенями для действия химических реагентов с целью ограниченной фрагментации являются функциональные группы относительно редких аминокислот, например метионина, триптофана и цистеина.

Потребность в методиках получения крупных фрагментов стимулирует все больший интерес к развитию специфических методов расщепления. В настоящей главе обсуждаются главным образом те методы, которые проверены на практике и нашли практическое применение. Наряду с хорошо известными методами расщепления по метионину, триптофану, тирозину и цистеину в данной главе рассматриваются также частичный кислотный гидролиз и восстановительное и окислительное расщепление по остаткам цистина. Литература по химической фрагментации пептидов и белков хорошо известна, поэтому авторы не ставили перед собой задачу охватить все аспекты проблемы. Читатель, проявляющий более глубокий интерес к этой тематике, может найти разнообразную информацию в обстоятельных обзорах [4, 74, 78, 81, 83, 181, 209].

2.2. Расщепление дисульфидных связей

Остатки цистина могут образовывать как внутри-, так и межцепочечные связи. Поэтому при секвенироваиии обязательным этапом является расщепление дисульфидных связей в первую очередь с целью разделения полипептидных цепей. В то же время дисульфидные связи имеют высокую реакционную способность, и это обстоятельство может вызвать осложнение при структурном анализе. Поэтому при расщеплении S—S-rpynn остатки цистеина необходимо перевести в стабильные производные. Наконец, после восстановления остатков цистеина белки становятся более доступными действию протеолитических ферментов. Способы расщепления дисульфидных связей рассматриваются в гл. 4. По этому вопросу имеется также ряд обзоров [26, 59, 98, 116]. В настоящую главу включены только те методики, которые нашли практическое применение.

2.2.1. Восстановление и S-карбоксиметилирование

К наиболее избирательным и практичным методам расщепления S—S-связей относится восстановление. Типовая методика заключается в обработке белка избытком низкомолекулярного тиола [уравнение (2.1)]. В качестве тиолов используют цисте-

белок

белок

| | + 2RSH | S—S S

SH SH

i + RSSR

(2.1)

6*

81 2. ФРАГМЕНТАЦИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ ХИМИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ

ин, восстановленный глутатион, 2-меркаптоэтиламин, тиоглико-левую кислоту, 2-меркаптоэтанол [78—80, 203] и дитиотреит (ДТТ) [29]. Восстановление проводят в атмосфере инертного газа в слабощелочной среде в присутствии 8 М мочевины или 6 М гуанидин-HCl. Следует напомнить, что при длительном хранении в растворах мочевины идет образование цианат-ио-нов, которые вызывают модификацию белков [182]. Рекомендуется использовать предварительно перекристаллизованиые препараты мочевины, свежеприготовленный раствор следует деионизировать на смешанном ионите.

После удаления восстановителя тиольные группы легко окисляются кислородом воздуха с замыканием S—S-связей. Поэтому для защиты SH-групп используют разнообразные группировки, получая устойчивые производные цистеина непосредственно в реакционной смеси, в которой проводилось восстановление. В качестве SH-реагента наиболее часто используется иодоуксусная кислота. Остатки цистеина переводятся при этом в S-карбоксиметилцистеин, который вполне устойчив при последующих операциях, включая секвенирование. Степень модификации определяют по данным аминокислотного анализа, используя устойчивость S-карбоксиметилцистеипа в условиях кислотного гидролиза. При этом одновременно определяют возможные потери других аминокислот (метионина, тирозина, гистидина) в результате побочных реакций [71].

Показано, что в кислой среде S-карбоксиметилцистеин (1) может подвергаться внутримолекулярной циклизации с образованием замещенного тиазина (2), который невозможно обнаружить с помощью аминокислотного анализа из-за потери

СООН СООН

I 1

H2N—СН

СН

HN "СН2

ос к

ноос- сн2 сн*

1 г

аминогруппы [15]. Скорость этой реакции зависит от температуры и рН. Оптимальные условия циклизации соответствуют рН 3,0 (цитратный буфер) и температуре 110°С, в то время как в обычных условиях кислотного гидролиза (6М НС1, 110°С, 22 ч) S-карбоксиметилцистеин вполне устойчив. С целью исключить возможность потери S-карбоксиметилцистеина в результате циклизации рекомендуется алкилировать SH-группы 3-бромопропионовой кислотой [15].

Типовая методика восстановления дисульфидных связей рибонуклеазы 2-меркаптоэтанолом и последующего карбокси-

2.2. РАСЩЕПЛЕНИЕ ДИСУЛЬФИДНЫХ СВЯЗЕЙ

85

метилирования приведена в работах [3, 35, 102]. В настоящее время наиболее широкое применение в качестве восстановителя находит дитиотреит (3) [106]. (Этот реагент — реактив Кле-ланда — был впервые применен для восстановления дисульфидов Клеландом [29].)

но он но он

RSCR + HSCH2CHCHCH2SH---> RSSCH2CHCHCH2SH + RSH (2.2)

3 4

Н с s

4 -----* 2 | | + RSH (2.3)

НОНС. /СН2

сн

i

ОН

Реакция идет, согласно уравнениям (2.2) и (2.3), почти количественно благодаря образованию более энергетически выгодного по сравнению с дисульфидами смешанного типа шести-членного цикла (5). При рН 7 и 25 °С окислительно-восстановительный потенциал дитиотреита составляет —0,33 В (для цистеина —0,22 В); отсюда константа суммарной реакции восстановления цистеина с помощью дитиотреита равна 104. Благодаря более низкому окислительно-восстановительному потенциалу и устойчивости к действию кислорода воздуха дитиотреит можно вводить в реакции в гораздо меньших концентрациях по сравнению с другими тиолами. Дополнительное преимущество использования дитиотреита связано с почти полным отсутствием у него неприятного запаха.

2.2.1.1. Восстановление и S-карбоксиметилирование. Методика [200]. Раствор белка (10—20 мг/мл) в 0,2—0,5 М ту?ис-НС1-буфере (рН 8,0), содержащем 6 М гуанидин-HCl и 2 мМ ЭДТА, в пробирке из полипропилена продувают азотом, плотно закрывают и инкубируют при 37—50 °С в течение 30 мин. Затем добавляют 50-кратный молярный избыток (в расчете на S—S-rpynny) ДТТ, а если количество S—S-связей неизвестно — 300 моль/моль белка, продувают азотом и инкубируют при 37 °С в течение 4 ч.

Реакционную смесь охлаждают до 0 °С, добавляют небольшой избыток (в расчете на SH-группу) перекристаллизованной иодоуксусной кислоты или иодоацетамида и инкубируют без доступа света. В процессе реакции в среде поддерживают рН 8,0. Спустя 1 ч избыток реагента нейтрализуют с помощью 2-меркаптоэтанола и раствор диализуют при щелочном рН и пониженной температуре. Указанные условия диализа препятствуют модификации метионина, которая вполне возможна, если вести диализ про.^в кислотного буфера. С целью обессоливания можно проводить гель-фильтрацию в подходящем буфере (на сефадексе G-10 или биогеле Р-10 в 0,01 м NH4HC03).

86 2. ФРАГМЕНТАЦИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ ХИМИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ

2.2.1.2. Восстановление трибутилфосфином. Эффективным и избирательным восстановителем дисульфидных связей в кератине (шерсти) является трибутилфосфин [119]. При исследовании восстановления белков известного строения было показано [152], что реакция идет стехиометрически согласно уравнению:

R1SSR2 + Bu3P + H20 —+ RiSH +Bu3PO (2.4),

При этом избыток восстановителя в расчете на S—S-группы составил 5—20%. В щелочной среде реакция идет с высокой скоростью, избирательно, почти количественно. Алкилированис образующихся SH-групп можно вести в присутствии восстановителя. В кислой среде реакция идет с низкой скоростью (время реакции 24—48 ч). Гомогенность среды создают добавлением 1-пропанола (до соотношения 1:1), что дополнительно способствует солюбилизации белка. Трибутилфосфин токсичен и имеет неприятный запах, работать с ним необходимо в вытяжном шкафу. Реагент и приготовленные растворы рекомендуется хранить под азотом, 2%-ный (об./об.) раствор в пропаполе имеет восстановительный эквивалент 55—70 мкмоль/мл.

Методика, предложенная в работе [152]. Бычью панкреатическую рибо-нуклеазу (64 мг, 5 мкмоль) растворяют в 7,5 мл 7 М мочевины в 0,1 М трис-HCI (рН 8,2), содержащем 1-пропанол (2:1). При перемешивании и атмосфере азота добавляют 50 мкл (130—180 мкмоль, 6—9-кратный избыток) трибутилфосфина. Спустя 2 ч добавляют 140 мкл 1 М иодоацетата (1 М иодоуксусной кислоты в 1 М NaOH, 3,5-кратный избыток в расчете на SH-группы) и инкубируют без доступа света. Спустя 5 мин доводят рН до 8,2 с помощью 1 М Na2C03; спустя 30 мин добавляют 0,5 мл ледяной уксусной кислоты и высушивают лиофилыго.

Дисульфидные связи можно восстанавливать с помощью других реагентов; однако эти методы не находят применения в аналитической химии белка. Например, восстановление борогидридом натрия (при рН 7—10) сопровождается расщеплением пептидных связей [35]; при реакции с дибораном идет восстановление карбоксильных групп (в виде карбоксилат-иона) в гидроксильные [5, 6]. В принципе диборанами можно восстанавливать белки с непротонированиыми карбоксильными группами. Редко в химии белка применяется электролитическое восстановление на ртутном капельном электроде [27, 111].

2.2.2. Другие защитные группы (по SH-rpynne)

Защитные группы должны удовлетворять разнообразным требованиям. В частности, защитная группа должна обеспечивать высокую растворимость модифицированного белка, нести хромофорную или флуоресцирующую группу или превращать модифицированный цистеин в потенциальный субстрат трипсина, наконец реакция модификации должна быть по возможности

2.2. РАСЩЕПЛЕНИЕ ДИСУЛЬФИДНЫХ СВЯЗЕЙ

87

обратимой. В принципе сульфгидрильные группы, как наиболее реакциониоспособные группы в белках, легко вступают в реакции алкилироваиия, арилирования, образуют комплексы с солями тяжелых металлов [59, 98, 104, 193].

2.2.2.1. Алкилирование с помощью этиленимина. S-Амино-этилцистеин — положительно заряженное производное цистеина— получают по реакции с этиленимином согласно уравнению (2.5) [114, 145, 146]. С помощью этой реакции в полипептидной

-SH + СН2 —СН2 -* белок & CH2-CHa-NH2 (2.5)

\ / N

Н

цепи создают аналог лизина — хорошую мишень для атаки трипсином. Однако протеолиз в этом случае идет с более низкой скоростью по сравнению с гидролизом по остаткам лизина и аргинина [32]. Алкилирование с помощью этиленимина сопровождается рядом побочных реакций, в частности может идти алкилирование метионина [166] или а-аминогруппы N-концевой аминокислоты [174]. При проведении реакции в течение длительного времени или в присутствии большого избытка реагента вероятность побочных реакций существенно возрастает. При аминокислотном анализе S-аминоэтилцистеин элюирустся в области основных аминокислот [166].

Восстановление трибутилфосфином и алкилирование этиленимином.

Методика 1. Растворяют белок (2—10 мг/мл) в смеси 0,5 М NaHC03— w-пропанол (1 : 1), устанавливают рН 8,0—8,3 и при перемешивании под азотом добавляют трибутилфосфин (1—5 мкмоль/мг белка) и этиленимип (4—40 мкмоль/мг белка); инкубируют в течение 2—4 ч.

Методика 2 [185]. Белок (25 мг ^-глобулина) растворяют в 5 мл свежеприготовленного раствора 8 М мочевины или 6 М гуанидин-HCl в 1 М трис-HCI-буфере (рН 8,9), содержащем 75 мкл 2-меркаптоэтанола. Инкубируют в атмосфере азота при 20 °С в течение 2 ч. Затем добавляют 150 мкл этиленимина

страница 13
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
промышленная мебель металлическая
участки в подмосковье новая рига д фролово
чиллер gwa/fc 622 s/k/p-im цена
моноколесо ips 191 купить

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(18.11.2017)