химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

ярных белках, поскольку в случае фибрина реакция восстановления борогидридом натрия (при рН 8) идет с низким выходом и плохо воспроизводима. Продукт реакции — аминонитрнл или производное аминокислоты, отражающее строе-

CN СООН

f-сн -сн

4NH2 NH2

CN СООН (-CH-NH—( +-СН

NH-^

ние альдимина. Продукты реакции устойчивы к кислотному гидролизу, легко отделяются от аминокислот и хорошо идентифицируются на аминокислотном анализаторе.

Тонко измельченный эластин (10 мг) суспендируют в воде (2 мл), добавляют 2 мг [14С]цианида натрия (удельная активность 1,1 мКи/мкмоль) и 2 мл 30%-ного аммиака. Затем реакционную смесь (рН 11,5) инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч, подкисляют до рН 1 и диализуют

V-cf + NaCN + NH3--*

Н

CH-N j + NaCN

1.5. СШИВАНИЕ ОЛИГОМЕРА И МОНОМЕРА

71

против 0,1 М НС1 при 4 °С. При модификации альдиминов присутствие аммиака не обязательно. Если вместо аммиака использовать меченный тритием метиламин, полученный альдегид будет содержать двойную метку. Поскольку удельная активность Na14CN известна, выход можно оценить количественно. Этот метод введения радиоактивной метки неприменим в случае пиридиниевой формы десмозинов.

Расщепление поперечных связей периодатным методом [146]. После вос-становлеЕшя поперечные связи коллагена можно расщепить путем окисления периодатом при комнатной температуре в течение 5 мин. Затем с помощью борогидрида калия разрушают избыток периодата, а продукты окисления восстанавливают до пролина и лизина, которые идентифицируют на аминокислотном анализаторе. Если восстанавливающий агент КВНд содержит три-тиевую метку 3Н, радиоактивная метка распределяется в соответствии с уравнением реакции;

СНСН2СН2( HOHCH.NHC Н*|СН:),СН

1) NalO.,

?) к вн.

i СООН + NHjCH*(CH2KCH

NH2

К восстановленному белку в 1 мл нитратного буфера (рН 5,3) добавляют 0,01 М NaI04 и выдерживают в темноте при комнатной температуре. Спустя 5 мин в реакционной смеси устанавливают с помощью 2 М NaOH рН 7,5 и добавляют КВН4 (2—5 мг). Инкубируют в течение 30 мин, а затем добавляют 6 М НС1 до рН 2.

Выделение пептидов, соединенных поперечными связями [169]. Для выделения пептидов, соединенных поперечными связями, с успехом используют хроматографию на гидрокснапатите. По-видимому, пептиды, сшитые поперечными связями, сохраняют конформацию нативного белка и благодаря этому проявляют большее сродство к гидрокснапатиту. Нативный или восстановленный нерастворимый коллаген (из кожи или костей быка) расщепляют бромоциаиом, смесь пептидов растворяют и дополнительно диализуют против стартового буфера (0,001 М Na2HP04, рН 6,8+1 М мочевина+ 0,15 М NaCl) и затем наносят на колонку (1,5X23 см) с гидроксиапатитом (Hypati-tc С). Проводят элюирование в линейном градиенте фосфатного буфера (в смеситель помещают 450 мл стартового 0,001 М фосфатного буфера; в резервуар 450 мл 0,2 М Na2HP04, рН 6,8, содержащего 1 М мочевины 0,15 М NaCl). После сбора 800 мл элюата элюирование продолжают в экспоненциальном градиенте. Для этого смеситель герметически соединяют с делительной воронкой, содержащей 450 мл более концентрированного буфера (0,8 М Na2HP04, рН 6,8+1 М мочевина+0,15 М NaCl). Элюат собирают по фракциям (объем 5,5 мл), скорость элюирования 60 мл/ч. Фракции, содержащие сшитые пептиды, объединяют, обессоливают диализом против воды и высушивают лиофильно. При восстановлении с помощью ЫаВяН4 гидроли-зата коллагена из костей быка были получены две главные и одна минорная фракции. Материал второй главной фракции имел максимальную молекулярную массу, характеризовался высокой степенью спирализации и действительно содержал сшитые пептиды.

СООН

сн сн2

| ;гн,

NH СН,

1.5.2.2. Десмозины. Для идентификации десмозина эластин восстанавливают NaBD4 в воде или D20, аминокислоты разделяют

72

1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОСТАВА БЕЛКОВЫХ ОЛИ ГОМЕРОВ

хроматографически или переводят в N-трифтороацетилметило-вые эфиры и анализируют масс-спектрометрически [129].

1.5.2.3. Изопептиды. Наиболее известным изопептидным фрагментом, связывающим полипептидные цепи в белках, является М'-^-глутамил) лизин [107, 117]. После полного ферментативного гидролиза белка или смеси пептидов этот фрагмент можно идентифицировать с помощью аминокислотного анализа. На кривой элюирования ему соответствует пик в области изолей-цина. Однако полное разрешение достигается лишь в особых условиях, например в буфере с рН 4,8. Относительно возможной роли №-((5-аспартил)лизина как сшивающего фрагмента см. работу [92].

1.6. Получение мономеров с целью секвенирования

В идеальном случае при секвенировании по Эдману хорошо подготовленных образцов выход N-коицсвой аминокислоты должен быть количественным. Иными словами, образцы не должны содержать солей, каких-либо примесей, а N-концевая аминокислота должна быть свободна от защитных групп. В процессе очистки следует исключить возможность модификации функциональных групп аминокислот, поскольку автоматическое секвенирование возможно при условии максимального выхода на каждом цикле. Меры предосторожности, исключающие блокирование N-коицевых аминокислот и образование гетерогенных препаратов, вкратце обсуждались в предыдущих разделах. В этот раздел включены специальные методики подготовки белков к анализу, в том числе способы делипидизации и отщепления олигосахаридпых цепей у гликоиротеипов с высоким содержанием углеводов.

1.6.1. Гидролиз N-концевой пироглутаминовой кислоты

Создание эффективного метода отщепления остатка пироглутаминовой кислоты решило проблему секвенирования белков, блокированных вследствие циклизации N-концевых Gin и Glu [136]. Поскольку благодаря «реакции деблокирования», протекающей с высоким выходом, становится доступной а-амино-группа последующего аминокислотного остатка, реакцию циклизации следует рассматривать как удобный способ создания защитной группы на стадиях очистки белка. Снятие защиты осуществляют путем двукратной инкубации с пироглутамат-аминопептидазой печени крупного рогатого скота. Метод был впервые использован при анализе легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов, а затем при анализе тяжелой цепи гемаг-глютинина вируса гриппа [181].

1.6. ПОЛУЧЕНИЕ МОНОМЕРОВ

73

1.6'.1.1. Отщепление N-концевого остатка пироглутаминовой кислоты [136]. Пироглутамат-аминопстидазу печени крупного рогатого скота (ь-иироглутамилпептид — гидролаза, КФ 3.4.11.8) хранят в лиофильно-высушеппом состоянии при —20 °С. Раствор (10 мл, 1 мг/мл) восстановленного и ал котированного белка диализуют при 4СС против 0,1 М фосфатного буфера (рН 8), содержащего 5 мМ ДТТ+ЮмМ ЭДТА+5%-иый (об.) глицерин. Затем препарат переносят в реакционную ампулу с герметически закрывающейся крышкой, добавляют 0,025 мг фермента, продувают азотом, плотно закрывают, перемешивают. Инкубацию проводят при 4°С в течение 9 ч при периодическом перемешивании. Добавляют вторую порцию фермента (0,025 мг) и вновь инкубируют в атмосфере азота при 20 °С в течение 14 ч. Реакционную смесь диализуют против 0,05 М уксусной кислоты, высушивают лиофильно, образец белка секвенируют в автоматическом режиме.

Разработан метод гидролиза пироглутаминовой кислоты с образованием Ыт-метилглутамина [125]. Защищенный пептид инкубируют в 17%-ном растворе метиламина при 37°С в течение 14 ч (или более). После дансилирования и последующего гидролиза идентифицируют ДНС-глутаминовую кислоту.

1.6.2. Восстановление сульфоксидов N-метилмеркаптоацетамидом

По результатам аминокислотного анализа трудно оцепить степень окисления остатков метионина на стадии подготовки белковых препаратов хотя бы потому, что в процессе гидролиза может идти обратная реакция частичного восстановления [156]. Однако о потерях метионина можно судить по низкому выходу при расщеплении бромоцианом [66]. Низкий выход цистина также может быть обусловлен образованием сульфо-ксида цистеина [85] или алкилцистеина [86]. Частичное окисление существенно затрудняет идентификацию соответствующих ФТГ-аминокислот при глубоком секвенировании. Из множества других реагентов N-метилмеркаптоацетамид наиболее эффективен как восстановитель S-оксида метионина [80]. Реакцию метионин-Б-оксида (1 мг/мл) с 0,7—2,8 М N-метилмеркаптоацетамидом проводят при рН 2,6—8,5 и 37 °С в течение 12—14 ч в атмосфере азота.

Восстановление сульфоксида S-карбокси метил цистеина в гептидах и белках проводят в те же условиях, однако время реакции увеличивают в 5 раз.

При окислении белка надмуравьиной кислотой метионин превращается в стабильный 5,5>-диоксид. Перед стадией окисления [87] остаток триптофана переводят в оксиндолил-3-ала-

74

1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОСТАВА БЕЛКОВЫХ ОЛИГОМЕРОВ

нин [155] или кинуренин [11], более стабильные в условиях деградации по Эдману. Метод, предложенный в работе [155], более специфичен (разд. 2.5.3). При превращении триптофана побочной реакцией является образование метионин-Б-оксида, который может быть избирательно восстановлен в метионцп [156].

1.6.3. Техника работы с липопротеинами

Апопротеины обычно готовят из липопротеинов путем экстракции липидов органическими растворителями (этанолом, смесями эфир — этанол, метанол — хлороформ), однако некоторые апопротеины частично растворимы в органических растворителях. Сывороточные липопротеины содержат фракцию низкомолекулярных пептидов, растворимых в этаноле и в меньшей степени в смеси этанол — эфир, тогда как высокомолекулярные липопротеины нерастворимы в органических растворителях [157]. Растворимость апопротеинов в органических растворителях уменьшается при понижении температуры. Имеются данные, что некоторые мембранные белки включают ковалентио связанные липиды [159].

1.6.3.1. Методики.

Экстракция липопротеинов низкой плотности [157]. Экстракцию проводят при —10 °С. Раствор белка (2—5 мг/мл) диализуют против 0,15 М NaCl, содержащего 1 мМ ЭДТА, а затем по каплям прибавляют к 50 мл смеси эфир — 95%-ный этанол (1:3) в круглодонной центрифужной пробирке на 50 мл. Экстракцию проводят в течение 2 ч при медленном вращении пробирки (15 об./мин). В заключение осадок отделяют центрифугированием при 2000 об./мин в течение 10 мин. Повторную экстракцию проводят аналогичным образом. В заключение осадок трижды промывают эфиром и высушивают в атмосфере азота. Для регенерации белка, частично перешедшего в органический растворитель, первый экстракт разбавляют эфиром (до соотношения этанол : эфир—3 : 5) и выдерживают при —10 °С в течение 12 ч.

Экстракция липопротеинов желтка куриного яйца [30]. Раствор липо-протеина в 1 М NaCl (~6% масс/об.) диализуют несколько раз против 6 М мочевины+0,05 М НС1 (рН 3,3) при 20 °С до почти исчерпывающего удаления NaCl. С целью ускорения обессоливания можно провести предварительный диализ против дистиллированной воды. К полученному раствору (17 мл) добавляют смесь хлороформ — метанол (20 мл+40 мл) и гомогенный раствор инкубируют при 20—25 °С в течение 30 мин, после чего добавляют 20 мл хлороформа. Нижний слой отбрасывают, верхний слой вторично экстрагируют 10 мл хлороформа. В случае необходимости эмульсию центрифугируют. Слой хлороформа отбрасывают, водный слой выдерживают при 20 °С в течение 20 ч, а затем диализуют против б М мочевины.

1.6.4. Отщепление олигосахаридных фрагментов гликопротеинов

Для отщепления олигосахаридных фрагментов гликопротеинов можно использовать продажный раствор HF в пиридине (реакцию проводят при комнатной температуре в течение 90 мин).

1 6. ПОЛУЧЕНИЕ МОНОМЕРОВ

75

Однако этот реагент не всегда действует столь эффективно, как безводный HF, который расщепляет гликозидные связи нейтральных и кислых Сахаров при 0°С в течение 1 ч [124]. К сожалению, при такой обработке изменяются физические свойства белка, хотя образец может быть вполне пригоден для секвенирования.

1.6.4. L Методика [124]. Реакцию с безводным фтороводородом проводят в специальной аппаратуре, например поставляемой фирмой Peninsula Lab. Inc. Тщательно высушенный образец гликопротеина (до 100 мг) и безводный метанол (до 10% от объема образца) помещают в реактор. Линию подачи HF вакуумируют, за исключением баллона с жидким HF. Реактор охлаждают сухим льдом в ацетоне и перегоняют в него 10 мл жидкого HF (в качестве поглотителя влаги в жидком HF используют трифторид кобальта). Перегонку проводят при осторожном вращении обоих сосудов. Реактор нагревают естественным путем до подходящей температуры (давление паров HF при 0 °С 364 мм рт. ст. и при 23 °С 850 мм рт. ст.) и с этого момента отсчитывают время начала реакции. Если реакцию проводят при 0°С, реактор охлаждают в ледяной бане. В заключение реактор эвакуируют через ловушку с СаО. С целью предотвращения вспенивания реакционной смеси вакуум следует набирать постепенно, но достаточно энергично, чтобы быстро отогнать IIP, не допуская олигомеризации. После упаривания HF линию выдерживают под вакуумом еще в течение 1 ч. О полноте удаления HF судят по переходу окраски реакционной смеси от светло-коричневой и красноватой в бесцветную. Затем образец растворяют в 0,1 М или 50%-ной уксусной кислоте и немедленно хроматографируют на колонке с сефадексом или диализуют.

При более жесткой обработке безводным HF (23 °С, 3 ч) идет расщепление О-гликозидных связей аминосахаров, однако пептидные и N-гликознд-ные связи не затрагиваются.

1.6.5. Обессоливание

Обычно мономер или полипептидные цепи обессоливают с помощью диализа или гель-фильтрации. Значение операции обессоливапия не следует недооценивать. Иногда, прежде чем вести диализ против воды, образец целесообразно диализовать против разбавленных электролитов или буферных растворов. В этом случае образец сохранит растворимость в воде после исчерпывающего обессоливапия. Для диализа в небольшом объеме выпускаются специальные ячейки.

Гель-фильтрация на заранее подготовленных колонках (разд. 1.2.2.1)—более быстрый способ обессоливания. Элюеит и параметры матрицы выбирают в соответствии с растворимостью и молекулярной массой исследуемого белка. Слаборастворимые гидрофобные белки растворяют в 98%-ной муравьиной кислоте, которую перед нанесением образца на колонку разбавляют до 75%-ной концентрации (разд. 1.3.2.1). Белки с молекулярной массой 5000—30 000 обессоливают на сефадексе G-25, более высокомолекулярные белки — на сефадексе G-50. Объем образца не должен превышать 1/3—1/4 объема колонки. Фирма Pharmacia выпускает колонки с сефадексом G-25, рассчи-

76

1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОСТАВА БЕЛКОВЫХ ОЛИГОМЕРОВ

тайные на быстрое (в течение 5 мин) обессоливание образцов объемом 2,5 мл.

1.6.5.1. Проведение обессоливания [83]. Небольшие пептиды обессоливают на колонках с биогелем Р-2 в 1 М уксусной кислоте или с сефадексом G-10 в 1 М NH4OH, а затем высушивают лиофильно.

Крупные пептиды и белки трижды диализуют в течение 12 ч против 0,15 М NaCl, содержащего 0,1% ДСН, а затем трижды против 0,02% ДСН. Если белок был выделен методом электрофореза в ПААГ — ДСН, элюат центрифугируют при 20 000 об./мин в течение 20 мин для удаления частиц акриламидного геля. Примеси красителя кумасси не мешают секвепированию. Однако следует помнить, что равновесное распределение ДСН через диализную мембрану — процесс медленный и может потребовать нескольки

страница 11
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
получение профатестата бухгалтер цена
ремонт холодильника Biryusa 133KLA
концерт киркорова н.новгород 2016г цена билета
автобус аренда москва свадьба

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(05.12.2016)