химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

кацией других аминокислот и частичным гидролизом лабильных пептидных связен. Поэтому для введения сульфогруппы предпочитают проводить восстановительное расщепление дисульфидных связей, а затем мягкое окисление SH-групп реагентами ряда сультонов (внутренних сложных эфиров сульфокислот) (см. разд. 1.5.1.2 и 2.2.2.3).

Обычно дисульфидные связи расщепляют восстановлением, *а полноту реакции контролируют с помощью реактива Эллмана [69, 102]. После восстановления образующиеся SH-группы алкилируют с целью исключить окисление с образованием цистина. Алкилирующий агент выбирают в соответствии с поставленной дополнительной задачей, например можно стремиться придать белку более высокую растворимость в водном буфере, ввести дополнительные точки для гидролиза трипсином или ввести лабильную защитную группу в расчете на последующую регенерацию SH-групп. Иногда защита по SH-rpyn-пам может оказаться излишней, поскольку белок с восстановленными S—S-связями может быть устойчив в уксусной кислоте на холоду при рН 3 [7].

1.5.1.1. Расщепление дисульфидов.

Окисление цистеина или дисульфидных связей в белках рекомендуется проводить с помощью надмуравьиной кислоты [78] (см. также разд. 2.2.3.1).

После проведения окисления определяют аминокислотный состав исследуемого белка, контролируя прежде всего содержание цистеиновой кислоты. Выход цистеиновой кислоты должен составлять >85%, а выход 5,5-диоксида метионина (при наличии остатка метионина) не менее 95%; триптофан при окислении разрушается полностью. При наличии хлоридов может происходить модификация тирозина, поэтому перед анализом рекомендуется удалять из образца ионы хлора. Колонку с дауэксом 2 (100 меш) в ацетатной форме промывают 3 М ацетатом натрия до отсутствия в элюате ионов хлора (контроль—реакция с нитратом серебра). Затем через колонку ^пропускают раствор белка (0,1 г белка на 1 мл объема ионита)

1.5. СШИВАНИЕ ОЛИГОМЕРА И МОНОМЕРА

65

и промывают небольшим объемом буфера. При этом следует учитывать возможность потери белка на колонке.

Восстановление S—S-связей проводят главным образом 2-меркаптоэтанолом. Однако при недостаточно высоком избытке 2-меркаптоэтанол образует смешанные дисульфиды, к тому же он обладает неприятным запахом. Удовлетворительными свойствами обладают дитиотреит и дитиоэритрит, которые при небольшом избытке обеспечивают полноту восстановления. В ряде работ дисульфидные связи восстанавливали трибутил-фосфином [150—152] (более детально эти методы обсуждаются в разд. 2.2.1).

Дисульфидные связи, соединяющие две или более полипептидные цепи, обычно доступны действию растворителей или реагентов даже в отсутствие денатурирующих агентов, тогда как виутрицепочечные S—S-связи чаще всего бывают маскированы и недоступны. Это обстоятельство позволяет проводить избирательное восстановление «экспонированных» S—S-связей. Полное восстановление дисульфидов рекомендуют проводить в слабокислой среде в присутствии мочевины или гунидингид-рохлорида. Ни один из денатурирующих агентов не свободен от недостатков. Например, примеси мочевины в образце генерируют цианат-ионы на стадии конденсации при деградации по Эдману, что может препятствовать секвенированию. Опыт применения гуанидин-HCl не столь поучителен, однако при использовании хорошо очищенного препарата проблем при сек-венировании не наблюдалось.

При исследовании ^-иммуноглобулина был разработан метод восстановления межцепочечных S—S-связей при сохранении внутрицепочечных [53].

В полученных фрагментах определяют содержание SH-групп или же смесь фракционируют в присутствии восстанавливающих агентов или в кислой среде. Для удобства работы тиолсодержащие фрагменты переводят в более стабильные или более растворимые производные.

Наиболее изученным, но вместе с тем не свободным от недостатков способом защиты SH-групп является карбоксимети-лирование [68]. Следует отметить, что, если стадию конверсии тиазолинонов в фенилтиогидантоины при секвенировании по Эдману проводить в недостаточно мягких условиях, наблюдаются значительные потери S-карбоксиметилцистеина [84]. Полезным приемом является алкилирование 14С-иодоацетами-дом, однако с успехом применяются и другие реагенты.

Если в дальнейшем планируется проводить исследование по ренатурации белка, можно получать производные с лабильными защитными группами. Некоторые из рекомендованных реагентов требуют осторожности в обращении. Например, иодоук-

5-703

66

I. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОСТАВА БЕЛКОВЫХ ОЛИГОМЕРОВ

сусная кислота — аллерген, и, как правило, с этим реактивом работают в резиновых перчатках при хорошей вентиляции (см. также гл. 2).

1.5.1.2. Обратимая модификация. При действии на цистин сульфита образуются цистеин и цистеинсульфонат (сульфоцистеин) (см. также разд. 2.2.4).

Дисульфидные связи можно реконструировать путем восстановления модифицированного белка и его ренатурации в присутствии кислорода воздуха. Окислительный сульфитолиз дисульфидов в присутствии солей меди приводит к образованию S-сульфонатов [37].

Аналогичные результаты были получены при реакции белка с сульфитом натрия в 8 М мочевине в присутствии кислорода воздуха и следов цистеина [31]. Восстановление цистина дитиотреитом и последующая обработка тетратионатом натрия приводит к образованию S-сульфоцистеииа с количественным выходом [85]. S-сульфоцистеин устойчив при нейтральном рН и в условиях деградации по Эдману, однако при восстановлении образует цистеин. При гидролизе белков 6М НС1 S-сульфоцистеин превращается в цистин [37]. Серьезную проблему представляет контроль за полнотой реакции: при использовании [35S]сульфита контроль ведут по включению метки [31].

При взаимодействии со-толуолсультона с восстановленным белком при рН 8,3 образуется S-2-сульфобензилцистеии [153].

Обратную реакцию проводят путем восстановления натрием в жидком аммиаке; с целью воспрепятствовать расщеплению связей Тге-Pro в реакционную смесь добавляют амид натрия. Белки, модифицированные путем сульфитолиза и сульфобеызи-лирования, хорошо ратворимы в воде.

Окислительный сульфитолиз [31]. Метод с успехом применялся при исследовании альдолазы, лектатдегидрогеназы и пепсиногена. Полнота реакции достигается только в диапазоне рН 7,0—8,5, что свидетельствует об участии

| -S-S-1 + SOf -> i-S + ¦ o.,s-s

(—S—S--| + 2SOl~ + Н20

2|—SS03" + 20Н

1.5. СШИВАНИЕ ОЛИГОМЕРА И МОНОМЕРА

67

в реакции протонированной аминогруппы цистеина. Образец белка (2 мг/мл) инкубируют в присутствии кислорода воздуха при 25 °С в течение 1 ч в растворе следующего состава: ОД М трис-HCI (рН 8,4)+8 М мочевина (или 6 М гуанидин-НС1)+0,05 М сульфит натрия, 0,2 мМ цистеин. По завершении реакции реакционную смесь диализуют и высушивают лиофилыю.

После сульфитолиза активный фермент (альзолазу) получают по следующей методике. Образец белка (0,5—1 мг/мл) растворяют в 0,1 М трис-НС1 (рН 7,5), содержащем 4 М мочевину, добавляют 2-меркаптоэтанол (до концентрации 0,7 моль/л) и инкубируют при 25 °С в течение 2 ч. Затем реакционную смесь разбавляют в 10 раз буферным раствором следующего состава: 0,1 М трис-HCI (рН 7,5) +2,5 мг/мл бычий сывороточный альбумин+25 мМ ЭДТЛ+10 мМ 2-меркаптоэтанол; инкубируют в присутствии кислорода воздуха и спустя 15 мин определяют активность ренатурированного фермента.

S-Сульфобензилирование [153]. Образец белка (100 мкмоль) в 100 мл 0,5 М бикарбоната натрия в смеси с пропанолом (1:1) инкубируют в атмосфере азота с трибутилфосфипом (330 мкмоль) и со-толуолсультоном (204 мг, 1200 мкмоль). Избыток со-толуолсультона отделяют фильтрованием, фильтрат упаривают до остаточного объема 40 мл и диализуют против воды. На аминокислотном анализаторе S-сульфобензилнистеин элюируется непосредственно после цистеиновой кислоты. При проведении реакции с инсулином выход производных цистеина количественный.

Снятие S-сульфобензильной группы [90]. 300 мг белка тщательно высушивают, растворяют в безводном жидком аммиаке (300 мл) в круглодонной колбе при охлаждении сухим льдом в ацетоне. Для защиты лабильных пептидных связей остатка пролила в реакционную смесь добавляют ~120 мг амида натрия. Последующие стадии проводят при температуре кипения жидкого аммиака. Предварительно приготовленный раствор металлического натрия в жидком аммиаке добавляют но каплям до тех пор, пока реакционная смесь не приобретает слабую голубую окраску. Выдерживают 30 с и добавляют несколько капель (2—3) ледяной уксусной кислоты до исчезновения окраски, затем аммиак упаривают до остаточного объема 10 мл. Остаток упаривают в вакууме на роторном испарителе и высушивают досуха на водоструйном насосе.

L5.L3. Окисление. Реконструкция большинства дисульфидных связей в некоторых белках достигается при окислении кислородом воздуха, т. е. при аэрировании раствора восстановленного белка [70]. По-видимому, молекуле иативного белка свойственна термодинамически наиболее выгодная конформация, и, следовательно, главным фактором, способствующим «правильному» сближению тиольных групп, является кооперативное (согласованнное) взаимодействие функциональных групп полипептидной цепи. Если распределение дисульфидных связей в белке определяется главным образом конформацией белка-предшественника (например, в случае инсулина проинсулином), то такие белки ренатурируют с трудом. Далее приводится общепринятая методика окисления белков с целью ренатурации, однако оптимальные условия реакции определяются в зависимости от индивидуальных свойств исследуемого белка, его первичной структуры и трехмерной укладки полипептидной цепи. Например, добавление 2-меркаптоэтанола и увеличение температуры до 38 °С оказались полезными при ренатурации

5*

68

1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОСТАВА БЕЛКОВЫХ ОЛИГОМЕРОВ

лизоцима, но неэффективными в случае рибонуклеазы [56]. В случае других белков оптимальную концентрацию 2-меркапто-этанола подбирают эмпирическим путем. Оба фактора — низкая концентрация белка и присутствие 2-меркаптоэтанола—препятствуют агрегации субъединиц и образованию межмолекулярных дисульфидных связей. Предполагают, что 2-меркаптоэтанол-катализирует дисульфидный обмен, необходимый для коррекции неправильно замкнутых остатков цистеина.

RSS—j

к

к

S —

+ RS"

Ионы металлов из-за связывания с тиолами ингибируют активацию. При активации используют медленный диализ денатурирующих агентов, например мочевины. Для доступа кислорода вполне достаточно проводить реакцию в открытых сосудах; активная аэрация не рекомендуется, так как может вызвать денатурацию белка.

Методика 1 [56]. Ренатурацию восстановленного лизоцима (0,025 мг/мл) проводят в 0,1 М трис-буфере (рН 8,5) при 38 °С в течение 2 ч в присутствии 2-меркаптоэтанола (при молярном отношении 2-меркаптоэтапол : цистеин = = 180 : 1). Выход активированного продукта 70%.

Методика 2 [52]. Восстановленные цепи инсулина (5 мг белка/мл) осаждают при рН 3,8 и тщательно промывают деаэрированным буфером на холоду. Окисление кислородом воздуха проводят в глициновом буфере (рН 10,6) при 35 °С. Репатриированный белок имеет 50%-ную активность по сравнению с кристаллическим препаратом. Активность полученного гормона зависит от относительного содержания в реакционной смеси полнпептидпых цепей; максимальный выход достигается при соотношении А: В=--1,5: 1.

1.5.2. Другие типы поперечных связей в белках

В белках встречаются иные типы межмолекулярных связей, с трудом поддающиеся анализу и специфическому расщеплению. Это альдимиииая связь (I) в коллагене [172], десмозин (II) и изодесмозин в эластине (могут связывать 4 полипептид-

сн

II

N

I

сн2

!

снон

о

(СН2)2

со

I

NH

I

(СН2)4

дегидрогидроксили-зинонорлейцин

II

десмозин

III

е-Су-глутамил)-лиэин

IV

дитирозин

1.5. СШИВАНИЕ ОЛИГОМЕРА И МОНОМЕРА

69

иые цепи) [67], изопептидные связи между е-аминогруппой лизина и амидной группой глутамина (III) в экстрацеллюляр-ьых структурных белках [10, 117] и, по-видимому, ди- (IV) и тритирозииы [109].

1.5.2.1. Альдимины. На первой стадии образования межмолекулярных связей в коллагенах происходит окислительное дезами-нирование N- и С-коицевых остатков лизина и гидроксилизина под действием фермента лизилоксидазы, представляющего собой медьсодержащий металлопротеин. Образующиеся альдегиды аллизин (СН2)зСНО и гидроксиаллизин

ь (СН2СНОНСН2СНО) вступают в реакцию конденсации в

|— (CH2)2CHOHCH2N^CHCHOH(CH2)2- ]

-> [-(CH2)2CHOHCH2NHCH2CO(CH2)2 -|

V

основном с е-аминогруппами гидроксилизина с образованием дегидрогидроксилизилнорлейцина (I) или дегидродигидрокси-лизилиорлейцина. Альдимины восстанавливаются по двойным связям с помощью борогидрида калия, в результате чего поперечная связь приобретает устойчивость к кислотному гидролизу. Однако дигидроксипроизводное лабильно и перегруппировывается в кетоимин гидроксилизил-5-кетонорлейции (V) [103]. После щелочного гидролиза коллагена, восстановленного борогидридом, выделены и охарактеризованы галактозил- и глюкогалактозилпроизводные этих фрагментов [145].

Обычно с целью идентификации альдимипиый фрагмент коллагена вначале стабилизируют путем восстановления (главным образом циапоборогидридом натрия) [147], затем проводят ферментативный гидролиз и выделяют сшитые между собой пептиды. Эти фрагменты несложно идентифицировать, если использовать восстанавливающий агент, содержащий тритие-вую метку. После восстановления и кислотного гидролиза коллагенов (из разных тканей) были выделены и идентифицирова-

ло^ )2 снонсн2—с==сн

(СН2)2

пы гидроксилизилнорлейцин, дигидроксилизилнорлейцин, гидроксимеродесмозин, гидроксиальдольгистидин и гистидил-гидроксимеродесмозин [172]. Кроме того, был получен и иден-

-N

I

=N VI

70

1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОСТАВА БЕЛКОВЫХ ОЛИГОМЕРОВ

тифицирован гидроксиальдольгистидин (IV) (образующийся из аллизина, гидроксиаллизина и гистидина), который не восстанавливается борогидридом, но устойчив к кислотному гидролизу [81].

Однако еще не решен вопрос, соответствуют ли эти соединения (и ряд других) фрагментам с поперечными связями в нативных белках (и если да, то насколько) или это артефакты и каким образом альдимины превращаются в устойчивые к восстановлению фрагменты в процессе старения организма [103].

Расщепление альдимина [58]. В желатине поперечные связи расщепляются под действием р-амипопропионитрпла. р-Лминопропионнтрил нейт|мли-зуют ледяной уксусной кислотой, добавляют буферный раствор, желатину, с помощью уксусной кислоты устанавливают рН 7,6 (в реакционной смеси

R-NHi

содержится желатины 1—2 мг/мл, р-амнпопропнонитрила 1,9 моль/л, уксусной кислоты 1,3 моль/л, трис 1,6 ммоль/л, .MgCI2 0,8 ммоль/л), добавляют несколько капель толуола, пробирку закрывают и смесь инкубируют при 38 °С в течение 48 ч.

Восстановление цианоборогидридом натрия [74]. Образец диализуют против 0,1 М натрий фосфатного буфера (рП 4,4) и течение 4 ч, добавляют цианоборогидрид натрия (белок : NaBIhCN = 30 : 1, по массе) и реакционную смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 24 ч. Затем диализуют и высушивают лиофилыю.

Восстановление [1'*С]цианидом натрия в аммиаке [130]. Этот метод специально разработан для идентификации поперечных связей в фибрилл

страница 10
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
сообщество системной склеродермии
КНС цифровые решения рекомендует 106R01400 с доставкой по Москве и другим регионам России.
беседки для дачи каркасные сборные
atlant хм 6324

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(27.06.2017)