ве ДНК (см. главу 3) и значении «активированной» формы энергии для биосинтеза полимерных молекул, А. Корнберг еще в 1955 г. указал на возможность синтеза ДНК энзиматическим путем в бесклеточной системе в присутствии изолированной из R coli ДНК-полимеразы и предшественников дезоксирибонук-леозидтрифосфатов. Реакция, практически осуикствленная в 1967 г., сводится к синтезу новой молекулы ДНК:

П, С1АТФ ^ I С!АМФ П, ;

ГГ, СИТФ Mg2*;ДНК-матрица ,, СП.'Ф П2

п3 С1ЦТФ ДНК-поли м ераза

+ (n1+n2+n3+n4)PP,

п4 СЛТФ

с'ЦГ'Ф п3 '

СТГ.'Ф П4 '

Химический смысл полимеризации состоит в том, что свободная 3' -гидроксильная группа матрицы атакует а-фосфатную группу соответствующего присоединяемого нуклеозидтрифосфата (определяется природой азотистого основания затравки), при этом происходят отщепление остатка пирофосфата и образование фосфодиэфирной связи. Далее свободный З'-гидроксил вновь присоединенного нуклеотида атакует а-фосфатную группу следующего нуклеозидтрифосфата, и таким путем продолжается процесс полимеризации, идущий в направлении 5'->3', антипараллельно матрице, оканчивающейся 5'-фосфатом:

»н

он

р.

О!

ДН.-ПОГИМ ЕРАЗА

+ РР

Реакция требует присутствия одноцепочечной ДНК или в крайнем случае небольшого полидезоксирибонуклеотида. В деталях выяснено значение предобразованной ДНК в механизмах действия ДНК-полимераз:

ДНК служит не только затравкой, но ж матрицей, на которой фермент комплементарно и антипараллельно синтезирует дочернюю цепь ДНК. Это можно представить в виде схемы:

•?I \

rITPl1

он ' нсз Ь(Р'

?]»Ч>:№*

J |l. I

: ГР '

^ f' ' -У " -ч

сцтф --^! г}- j ц. ,

, -1- 17 [ iIA1 ф —•—,_Т -( I'. '—^—1

j Tl > ^ГТФ -ч N

IP 15'

Были предприняты другие подходы к выяснению механизма поли-меразной реакции. В лаборатории .А. Корнберга был открыт фаг (фХ174, содержащий одноцепочечную кольцевую ДНК. Эту молекулу использовали л качестве матрицы в ДНК полтгмсрязттой рсяктцпт и получили биоло шчески активную ДНК фага, использовав фермет ДПК лпгазу, обла дающую способностью катализировать соедипеппе (сшивку) концов раз рьшов в молекуле ДИК. Было показано, что в процессе реп'шкащш одноцепочечная ДНК фага (фХ174 проходит стадию образования двухцепочечной кольцевой ДНК. Применив ряд остроумных подходов, А. Корнберг и сотр. в опытах in vitro создали искусственную молекулу фага <рХ174, обладаю щ>ю способностью поражать (инфицировать) Г. coli. вызывая лизис бактерии- Последовательность событий может быть представлена на схеме, ]де исходная молекула кольцевой Д.ПК фага фХ174 обозначена плюсом (+), а вновь синтезируемая молекула—минусом {-) (ряс 13.1). JVL Мезельсон ж Ф. Сталь показали полуконсервативный механизм репликации ДНК, включающий образование дочерних молекул ДНК, в каждой из которых сохраняется литпь одна родительская" цепь (рис. 13.2; 13.3).

(?ложность процесса репликации ДПК объясняется тем, что обе цепи реплицируются одновременно, хотя имеют разное направление (5' >3' н 3' >У); кроме тою, рост дочерних цепей также должен происходить в противоположных направлениях. Элонгация каждой дочерней цепи может осуществляться только в направлении 5->3'. Р. Оказаки высказал предположение, подтвержденное экспериментальными данными, что синтез одной из дочсртптх цепей осуществляется непрерывно в одттом ттяпряплетши, в то время Как синтез дру] оЬ дочерней цепи происходит прерывисто, путем соединения коренких (фрагментов (в чсоь автора названы фрагментами Оказаки), в свою очередь сшпезпр>ющтьчея в противоположном 1таттрав лении (рис. 13.4).

Как видно, синтез ведущей цепи ДНК идет всегда в направлении 5'—>3', соответствующем направлению движения репликационной вилки. Сохраняя правило синтеза дочериirx молекул ДПК >' >3'? синтез па второй цепи родительской ДПК щет в направлении, противоположном движению репликационной вилки. It зависимости от типа тлеткн фрагменты Оказаки

Кольцевая , . однсцепочечная \/ ДНК фага фХ174

ДНК-полимеразе j

ДН К-полимераза

Образование

незамкнутой у , ксмплементарчой

\ V^// днк

ДНК-лиг&за

^пользование новой молекулы

ДНК в качестве матрицы

"О;

Замытание кольца

Эамышние цепи

Разрьв в исходной цепиДНК

Эндонуклеаза""1

' О;

НАГРЕВАНИЕ

1 ч Денатурация

F "' СО исходной

Эндону гле а зТ|

и

1НИВГК

НАГРЕВАНИЕ

Разрьв в (-) цепи

Денатурация (-)цели

(+)Днк

Синтезированная молекулаДНК

^—S Новая синтетическая

кольцевая ДНК, 1/щентичная исходной ДНК фага (гЖ174

Рис 13.1. Роль ДНК-полимеразы и ДНК-лигазы в синтезе кольцевой одноцепочеч-ной ДНК фага. q>X174.

имеют разные размеры - от нескольких сот до нескольких тысяч нуклеотидов (150-200 у эукариот и 1000-2000 у бактерий).

Получены доказательства, что образование каждого фрагмента Оказаки требует наличия короткого затравочного комплементарного праймера — участка РНК, синтез которого катализируется праймазой. Затем при участии ДНК-полимеразы III синтезируются длинные участки ДНК. РНК-затра