стаются физико-химические методы (гравиметрические, осмометрические, вискозиметрические, электрофоретические, оптические и др.). На практике наиболее часто используются методы седиментационного анализа, гель-хроматография и гель-электрофорез. Определение молекулярной массы белков методами седиментационного анализа проводят в ультрацентрифугах*, в которых удается создать центробежные ускорения

* Впервые ультрацентрифуга была сконструирована шведским ученым Т. Сведбергом. Прибор был снабжен оптической приставкой, способнойпериодическичерез равные промежутки времени фотографировать процесс осаждения (седиментации) белковых частиц.

^jfcJr* JL X IB'V' i УМ 111 itiiiliinlCi* ДЛ»^ I I LF 1^»' JLr -Jmi \r \J \s W ЖХ \»» V.«r Ь^СЛи-г у \r* M\J**J Ж JLx X^r" sJ^lVJLJLAKyJL JL JL L/ЖХ JL JPXJTпЛв* Ж X Ж XVI <

^ihssV / ils ' ль *F -A jy

Обычно вычисляют молекулярную массу по скорости седиментации молекул белка или седиментационному равновесию. По мере перемещения молекул от центра к периферии образуется резкая граница растворитель-белок (ретттстрттруетс я автомятп1 icckh). Оптические свойства растворителя и белка используются iipii oiг|куделении скорости седимент;ниш; последнюю выражают че|>ез константу седиментации s, которая зависит как от массы» гак и от формы белковоП частицы:

1де г скорость перемещения границы растворитель белок, см/с; «о учло вая скорость ротора, рад/с;/- расстояние от центра ротора до середины ячеМки с раствором белка, см. Константа седиментации имеет размерность времени (ее выражают в секундах). Величина константы седиментации, равная 1 • 1СГП с, условно принята за единицу и названа сведбергом (S). Значения констант седиментации большинства белков лежат в пределах 1 50 S, хотя в ряде случаев эти значения щкчщщаюх 100 S.

Для вычисления молекулярном массы (М), помимо константы еедпмеп тации, необходимы дополнительные сведения о плотности раствори к i i и белка и другие согласно уравнению Сведберга:

М

Я

где R - газовая постоянная, прг/(моль-град); / абсолютная температура (по шкале Кельвина); 5-константа седиментации; р плотность раствори теля; v — парциальный удельный объем молекулы белка; D - коэффициент диффузии.

Определение молекулярной массы белков методом ультр аце нтри фут и-рования тттебует много времени и сложном и доро] oci оя1цеи аппаратуры. Полому в последние годы разработаны два более простых метода fiejib хроматография п электрофорез). При использовании гель хроматографии в первую очередь требуется откалиброватъ колонку. Для уми через колонку с сефадексом пропускают несколько белков с известными молекулярными массами и строят график, откладывая значения логарифмов

IVtOJICKyJT?ГрТТО"Й" тУГЛОСТ>Т TTJ^OTTl Ht НК 3JT^0X|^HOBUHLJbDC О^ЯЕэОМОВ| KOTOplJC ВСЗХОДЯТ| ЖЖК

показяпо па рпс. 1.9.

Известно, что меж,.1!,}' логарифмом молекулярной массы бедка, имеющего сферическую форму, и элюционным объемом существует прямая зависимость. Поэтому легко определить молекулярную массу исследуемого белка, зная его объем элюции. Второй разновидностью этого метода является тонкослойная гель-хроматография. Длина пробега белка (в миллиметрах)

Рис, 1.9. Измсрешю иуьема элюции (%).

Рис. 1.10. Зависимость между длиной пробега белковых частиц при гель-хроматографии в тонком слое сефадекса ]' l.so (иержтонкого) и их молекулярными массами (в полулогарифмической системе координат).

1 - рибонуклеаза; 2 - химотрипсиноген; 3 -яичный альбумин; 4 - сывороточный альбумин; 5- ^-глобулин; Х-белок с неизвестной молекулярной массой.

через тонкий слой сефадекса находится в логарифмиче ской зависимости от молекулярной массы белка (рис. 1.10).

Гель-хроматография, кроме простоты и быстроты, имеет дополнительное преимущество: не требуется выделять белок в чистом виде, так как примеси других белков по мешают определению, поскольку каждый из них проходит через колонку со свойственной ему скоростью, определяемой молекулярной массой. Это обстоятельство широко используется в энзимологии, когда оказывается возможным определение молекулярной массы даже очень небольшого количества фермента в присутствии других белков, не обладающих аналогичной каталитической активностью.

При использовании диск электрофонам в полпакрплампдном геле для oiнаделения молекулярном массы белков также строят график зав] 1СИМОСТИ между логарифмом молекулярной массы калибровочных белков н нодвпж костью белковых частиц в пош1акр1шамидном геле, а затем, определив подвижность исследуемого белка, по графику находят его массу (рис. 1.11). Электрофорез проводят в присутствии детергента додецилсульфата натрия, так как только в этом случае наблюдается прямая пропорциональная зависимость меж,!|,у молекулярной массой п подвижностью белков. Ьелки с четвертичной структурой при них условиях распадаются па еуб^дишщы, поэтому метод находит широкое применение для оп|>еделеппя молекуляр ной массы субъединиц белка.

Рве 1.1L Зависимость между молекулярной массой и относительной подвижностью белка при диск-