химический каталог




Введение в биотехнологию

Автор М.Е.Бекер

а'.!

гируются из них водой или разбавленными растворами солей. За-|

тем эти ферменты очищают и отделяют друг от друга, фракциони-j

руя сульфатом аммония. 1

Ферменты, связанные со структурными элементами клеток,!

можно выделить только после разрушения клеточной оболочки —]

дезинтеграции. Клетки можно разрушить механически — расти-]

рая, замораживая и оттаивая, подвергая действию ультразвука,!

или же ферментативно, используя специальные ферментные пре-1

параты. 1

Для разрушения клеток биомассу вначале промывают деци-|

молярным раствором сахарозы (рН 7,3), содержащим какой-либо!

буфер, этилендиаминтетрауксусную кислоту и альбумин. Затем!

добавляют стеклянные микрошарики и гомогенизируют в дезин-j

теграторе 1—2 мин при 13000 об/мин. Клеточные стенки и стек- ]

лянные микрошарики отделяют центрифугированием. I

Если фермент содержится в липопротеидных комплексах, не | растворимых в воде, тогда при помощи бутилового спирта в ко- I личестве 3—6% объема ферментного раствора из него извлекают липиды. Фермент остается в водном слое, а липиды переходят в слой бутилового спирта.

Концентрирование растворов ферментов достигают, избавляясь прежде всего от балластных белков. Если фермент термостабилен, например рибонуклеаза, то от белков освобождаются нагреванием раствора. Осадок отделяют центрифугированием. Иногда от белков освобождаются денатурируя их кислотами или воздействуя на ферментный раствор хлороформом или смесью хлороформа и спирта при низкой температуре.

После частичного удаления балластных белков для последующего концентрирования ферментов используют фракционирование растворами солей, например, сульфата аммония. В этом случае надо найти такую концентрацию солей, при которой неактивные белки коагулируют, а активный фермент остается в растворе. Осадок'отделяют центрифугированием и после лиофи-лизации надосадочной жидкости получают ферментный препарат.

Для коагуляции белков и очистки фермента используют также органические растворители — ацетон, этиловый спирт, метиловый спирт, диоксан.

Перспективным методом очистки ферментов является селективная, или избирательная, адсорбция, при использовании каоли- " на, трифосфата кальция, гидроокиси алюминия и других адсорбентов, которые небольшими порциями добавляются к фермент- :

202 ному раствору. Таким образом, проводят адсорбцию либо активного фермента, либо балластных белков. Разделение происходит при центрифугировании. Для элюирования фермента из адсорбента используют раствор фосфатного буфера. Если в ферментном растворе много неорганических солей, перед адсорбцией проводят диализ или фильтрацию раствора через сефадекс.

Дальнейшую очистку ферментного препарата, содержащего в небольших количествах примеси белков, сходных по физико-химическим свойствам с ферментом, ведут методом ионообменной хроматографии. Белки в ионообменном процессе взаимодействуют с ионитом и при помощи электростатического взаимодействия связываются с его поверхностью. Для элюирования белков с поверхности ионита используют изменение концентрации при рН пропускаемого через ионит буфера или введение нейтральных солей (NaCl, КС1).

В последнее время для разделения ферментов широко используют иониты на основе целлюлозы.

Для окончательного фракционирования белков используют также электрофорез, в основе которого лежит разделение кислых и основных молекул белков по их заряду в электрическом поле. Ферменты при достаточной степени очистки их раствора можно получить и в кристаллическом виде. Кристаллизацию ферментов проводят из растворов сульфата аммония, спирта или органических растворителей. К концентрированному раствору фермента осторожно по каплям добавляют насыщенный раствор сульфата аммония или спирт до появления едва заметной мути. Затем раствор на несколько дней оставляют на холоде. Выпавшие кристаллы отделяют и ведут перекристаллизацию до тех пор, пока продолжает увеличиваться активность фермента.

Биомасса дрожжей богата коферментом НАД (никотинамид-адениннуклеотид). Препарат НАД, необходимый для работы в биохимических лабораториях, можно получить из экстракта хлебопекарных дрожжей. Экстракцию ведут водой (82—85°С) в присутствии препарата аэросила А-300. Затем фильтрат, охлажденный до температуры 25—30°С, рН которого 6,0—6,1, пропускают через ионообменные смолы КУ-23 (Н+-форма). НАД элюируют 0,005 н. соляной кислотой. Полученный элюат еще раз пропускают через колонку с АН-231 (Cb-форма) и затем элюируют дистиллированной водой. Для дальнейшей очистки полученный раствор НАД пропускают через колонку с КУ-23 (Н+-форма) и только после элюирования 0,1 н. раствором аммоний-ацетатного буфера (рН 5,8—5,9) получают раствор, содержащий 95—99% пиридиновых коферментов, из которых 62—65% составляет активный кофермент НАД. Выход НАД при такой обработке составляет 50—60%.

8* 203

Иммобилизация ферментов и целых клеток микроорганизмов

В биологических объектах ферменты обычно находятся в фиксированном состоянии на поверхности различных клеточных структур — наиболее ча

страница 71
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81

Скачать книгу "Введение в биотехнологию" (2.32Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
Продажа элитных квартир на метро Александровский Cад
купила билеты родителям на киркорова
Посуда Овальные интернет магазин
светодиодные лампы с возможностью диммирования

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(27.02.2017)