химический каталог




Химия протеолиза

Автор В.К.Антонов

ядка №са1/К^)-В серии однотипных субстратов скорость гидролиза в растворе практически не зависит от типа субстрата, т.е. для всех веществ серии должны быть одинаковыми значения fta-ft5 И Кп- Отсюда следует, что отношение констант скорости второго порядка для двух субстратов должно быть:

cat ш 1 р Q a

р Q a

(36)

Относительные величины к . и К' зависят от значений констант К и EL

cat m р n Q

(табл.82).

Из табл.82 видно, что возможны три случая: а) когда специфичность проявляется только в Г (1 и 3); в) когда специфичность проявляется как в й t, так ивГ (2 и 4); в этих случаях может соблюдаться принцип "лучшее связывание - лучший катализ" (1962]; в) если участки первичной специфичности у ряда субстратов одинаковые или очень сходные, то К^1)»К^2). При этом специфичность будет проявляться только в значении каталитических констант (ftcat), а величины будут для всех субстратов практически одинаковыми (случай 4).

Таблица 82. Отношение кинетических констант двух субстратов

Условия Значение Номер п/п К р К Кп п Q К К К р п Q ft(1>/ft(2J cat cat m m

К (1)K(2)K<2) e p Q

1 »1 »1 1 s p Q

2 >А «1 - Q /KQ ?" p й(2)й(1) s p

3 «1 »1 1 P Q Как (1 ) й<1) e

4 «1. «1

P Q K(2) a

378

Глава восьмая. Специфичность и эффективность. Теории и гипотезы

8.9.3. Термодинамическое рассмотрение модели

Запишем цикл равновесий, соответствущий схеме (29):

Я

Е S ^—— Е S

р п

Е + S "^р^а

Е + S Е S

а р а

Я*^Ч\ Я„ к*

Kf

S* ц. Е S**

а р а

+ +

Е продукты

[Е S**] р а

где Я = -, характеризует сродство фермента к переходному состоянию

[EHS*] EES*]

а р а

активной формы субстрата, а Я = - отражает сродство фермента к ос-

а (EHS ]

а,

новному состоянию последнего; К*, К* - константы равновесия активированных комплексов для неферментативной и ферментативной реакций соответственно, и остальные константы имеют тот же смысл, что и в схеме (29). При рассмотрении наружного цикла равновесий легко показать (учитывая, что по условию модели Я* = Я*), что

f п

Я я

е р

V

Таким образом, переходное состояние неферментативной реакции превращения неактивной формы субстрата в продукт (в рамках нашей модели понятие условное, так как неактивная форма субстрата непосредственно в продукт не превращается) стабилизируется относительно неактивной формы в основном состоянии. Если, однако, рассмотреть нижний внутренний цикл равновесий, где К - [Е S*]/[E][S 1, то можно убедиться, что стабилизация переходного сое-тояния активной формы по отношению к основному состоянию этой формы не происходит, т.е. Ка = КТ.

Таким образом, в предлагаемой модели фермент стабилизирует основное состояние активной формы субстрата и "переходное состояние" неактивной формы. Это означает, что напряжение (в термодинамическом смысле) активной формы субстрата в фермент-субстратном комплексе отсутствует.

Важное отличие этой модели от изложенных ранее теорий заключается в том, что все факторы, определяющие эффективность и специфичность катализа, она относит к основному состоянию субстрата в продуктивном фермент-субстратном комплексе, объясняя вместе с тем понижение кажущегося активационного барьера реакции.

8.10. Пути к общей теории протеолиза

379

Вклад в катализ могут вносить все те эффекты, о которых говорилось в разд.8.2, если их проявление в основном состоянии стабилизирует активную форму субстрата в комплексе с ферментом.

Дополнительным источником ускорения могут быть факторы, проявляющиеся на стадии собственно химического превращения, такие, как общий катализ, поли-функциональность катализа и т. п.

8.10. Пути к общей теории протеолиза

Изложенная в предыдущем разделе концепция вместе с конкретными сведениями о химии активных центров ферментов может стать хорошей основой для построения общей теории ферментативного гидролиза производных карбоновых кислот. Такая теория должна: а) с единых позиций объяснять каталитическую эффективность амидгидролаз; исходя из знания структуры субстрата и фермента, предсказывать величину каталитического ускорения реакции; в) объяснять различные проявления специфичности ферментов как в ряду субстратов, так и у разных амидгидролаз; в) объяснять регуляторные особенности ферментов. Пока ни одна из существующих моделей не в состоянии удовлетворить всем этим требованиям.

Рассмотрим с этой точки зрения предложенную выше модель. Здесь необходимо в первую очередь ответить на вопрос: что представляет собой постулируемая моделью активная форма субстрата применительно к субстратам амидгидролаз?

Основной причиной низкой реакционной способности амидов в гидролитических реакциях является резонансная стабилизация амидной группы. Нарушение п-тс-сопряжения приводит к резкому возрастанию реакционной способности, что видно, например, из сравнения скоростей гидролиза амидов и бициклических 6-лактамов (типа пенициллинов).

Анализ немногочисленных рентгеноструктурных данных показывает, что в фермент-субстратных комплексах вполне возможны искажения структуры амидной группы за счет, главным образом, ее пирамидализации. Это приводит к нарушению резонансной стабилизации амида, изменению порядков связей C-N и С-0 и увеличению положительного заряда на карбонильном углероде.

Таким образом, вполне вероятно, что именно это состояние деформированной (пирамидализованной) амидной связи и является той активной формой субстрата, которая стабилизируется в продуктивном фермент-субстратном комплексе. В

растворе эта форма термодинамически невыгодна. Как видно из рис. 26, при

о

степени пирамидализации дси0,2 А изменение энтальпии составляет около 20 ккал/моль, что не выходит за рамки общего изменения энергии при фермент-субстратном взаимодействии. Следует также учитывать возможность некоторого увеличения энтропии при этом процессе вследствие увеличения степеней свободы внутреннего вращения, а также возможность стабилизации пирамидализованной структуры за счет гидратации увеличивающихся в этом процессе зарядов. Я полагаю, что близкая к реальности оценка изменения свободной энергии при указанной степени пирамидализации в растворе составляет +15 ккал/моль. Отсюда оценка величины Кп (в формуле (34)1 составит около 7-Ю-10.

Конечно, не каждый субстрат, образуя . продуктивный комплекс, реализует

о

степень пирамидализации порядка 0,2 А. То же относится и к субстрату, обра-

380

Глава восьмая. Специфичность и эффективность. Теории и гипотезы

эующему комплекс с разными ферментами. Задача заключается в том, чтобы установить степень оптимального нарушения резонансной стабилизации для разных фермент-субстратных комплексов.

Попробуем оценить другие параметры, определяющие эффективность катализа в нашей модели. Значение Ка легко определяется из данных стационарной кинетики, если справедливо равенство iT=Ke- В рамках модели это условие реализуется, когда Кр<1 и KnKQОценить значение Кр значительно труднее. Изменение свободной энергии на этой стадии определяется эффективностью вторичных взаимодействий, которые должны компенсировать потерю системой вращательных степеней свободы. Экспериментальные значения, полученные в опытах остановленного потока или температурного скачка (см. разд.6.2.3), возможно, характеризуют кажущееся значение Кр, включающее свободную энергию стабилизации реагирующего фрагмента молекулы. Эти значения для многих исследованных соединений невелики и лежат в области Кр=5-20 (см. табл.68). Лишь для пента- и гексапептидов - субстратов папаина значение константы равновесия второго комплекса составляет 120-250, что соответствует изменению свободной энергии на 2,8-3,3 ккал на моль. Однако тот факт, что многие ингибиторы, как белковые, так и "аналоги переходного состояния", имеют константы ассоциации порядка 1•1010 М-1, показывает, что общая величина изменения свободной энергии комплексообразования может быть значительно выше.

Теоретическая оценка минимальной величины Кр может быть сделана из предположения о строении комплекса EQSn и числа вращательных степеней свободы, которые система теряет при образовании комплекса Е s^. Например если предположить, что в комплексе EoSn субстрат AcPheAlaNH2 взаимодействует с химотрипсином только своей ароматической группой, то переход в комплекс EpSn должен сопровождаться замораживанием свободного вращения вокруг 9 о-связей. Это приведет к потере энтропии около 45 э.е. [2453], т. е. порядка 13 ккал на моль. Эта величина частично компенсируется увеличением энтропии за счет сольватации и должна полностью компенсироваться за счет образования связей с ферментом. Такие оценки, конечно, крайне приблизительны, но в принципе расчет величин Кр вполне реален.

Величина энергии стабилизации активной формы субстрата может быть получена из формулы (35), если известны значения К и К и отношение констант

р з

скоростей второго порядка для ферментативной и неферментативной реакций. Если это отношение составляет Ю10 (см. табл.50), а величина К <*1-10~л М, то даже при Кр=1 величина KQ=10 , что соответствует изменению свободной энергии на 13,5 ккал/моль. Такая величина представляется мне вполне разумной.

8.10. Пути к общей теории протеолиза

381

Какова константа скорости собственно химического превращения субстрата (&5)? Тот факт, что амидгидролазы способны превращать субстраты со скоростями, близкими к диффузионно-контролируемым, свидетельствует о том, что эта константа может быть сравнима с константами скоростей таких реакций (Ю8-Ю9 с-1). Таким образом, допущение, принятое выше, о быстром установлении равновесия в схеме (29) вряд ли оправдывается, и на самом деле лимитирующей стадией является одна из нехимических стадий (см. также: (17161).

ЧВ этом случае определяемые из рН-зависимости скорости реакции значения р#а функциональных групп фермента имеют смысл кинетических р#а (см. разд. 5.2.2). Возможно, что именно с этим обстоятельством связана довольно часто наблюдающаяся зависимость значений рКа групп свободного фермента от типа используемого для определения субстрата.

В рамках предлагаемой модели непродуктивное связывание должно преимущественно происходить на стадии образования фиксированного комплекса фермента с неактивной (EpSn) или активной (EpSa) формами субстрата. При этом соответствующая величина константы равновесия (йп или Кр) будет изменяться на величину K{=(EpS']/[E si, где Eps' - непродуктивный комплекс, т. е. на величину K'=Kp+Kt, причем эти изменения будут одинаковым образом сказываться на величинах &cat и й^, но не будут влиять на их отношение.

Кинетический изотопный эффект растворителя обычно относят к лимитирующему скорость всего процесса переносу протона. В условиях быстрого химического превращения субстрата этот эффект не должен проявляться. Однако, если предшествующие химическому превращению стадии связаны с переносом протона, то эффект может наблюдаться. Кроме того, модель постулирует дестабилизацию расщепляемой связи в гпродуктивном комплексе, которая может быть связана с частичным переносом протона.

Итак, в основе предлагаемой модели применительно к амидгидролазам лежит концепция, связывающая все события, обусловливающие эффективность и специфичность катализа с особенностями основного состояния субстрата в фермент-субстратном комплексе. Эти особенности заключаются в деформации и резонансной дестабилизации гидролизуемой связи за счет ее расположения вблизи нуклеофила на расстоянии, меньшем суммы Ван-дер-ваальсовых радиусов реагирующих атомов. Потери энергии при этом компенсируются как взаимодействием не-реагирующей части субстрата с ферментом, так и частичным перекрыванием связывающих орбиталей нуклеофила и карбонильного С-атома (см. разд.7.6). Это не приводит к напряжениям в продуктивном комплексе по сравнению с аналогичным основным состоянием субстрата в растворе.

Я вижу основное достоинство предлагаемой модели в том, что она практически не оперирует с переходным состоянием реакции, изучение которого физическими и химическими методами гфинцшшально невозможно, а имеет дело с состояниями, вполне поддающимися изучению. Конечно, на этой стадии модель еще далека от совершенства. Так, факт деформации реагирующей группы обнаружен в комплексах ограниченного числа ферментов с ингибиторами, и нет уверенности, что он отражает состояние истинных фермент-субстратных комплексов. Отсутствуют также сведения о характере взаимодействий на стадиях обра зования сорбционных.и фиксированных комплексов, хотя сам факт стадийности комплексообразования не вызывает сомнения. Дальнейшей разработки требуют вопросы, связанные с рН-зависимостью катализа, изотопными эффектами и т. д.

382

Глава восьмая. Специфичность и эффективность. Теории л гипотезы

Центральным вопросом является разработка методов количественного предсказания эффективности, и. специфичности катализа амидгидролазами, особенно в случае пептидных субстратов. Обнадеживающий путь здесь открывают соотношения линейности свободных энергий. Однако и в этом случае значительные трудности ожидают исследователей, в частности, при объяснении уникальной специфичности некоторых протеаз.

Практически очень мало исследован сам элементарный акт химической трансформации субстрата. В этом отношении важную роль призваны сыграть квантово-химические методы исследования.

Перечисленные здесь проблемы намечают очень схематично программу дальнейшего исследования реакции протеолиза одного из важнейших процессов жизнедеятельности, программу, реализация которой будет важна не только для решения поставленных выше частных вопросов, но и для химической энзимологии в целом.

8.11. Заключение

Недостатком большинства существующих теорий ферментативного катализа является игнорирование того обстоятельства, что основное состояние продуктивного фермент-субстратного комплекса структурно и химически отличается от основного состояния конгруэнтной модельной реакции. Учет этого фактора снимает многие трудности в объяснении эффективности и специфичности ферментов. Фермент как бы "готовит"' субстрат к элементарному акту, изменяя свою комплементарность к разным состояниям субстрата по мере его продвижения по координате реакции. Это приводит к тому, что сам элементарный акт происходит с весьма низкими энергиями активации. Такие представления помогают наметить путь к построению общей теории

страница 59
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Химия протеолиза" (8.49Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
проектор и экран в прокат гаян ульяновск
Фирма Ренессанс: деревянные лестницы на второй этаж фото- быстро, качественно, недорого!
кресло престиж кожзам
Компьютерная техника в КНС Нева - Lenovo ThinkPad - кредит онлайн не выходя из дома в Санкт-Петербурге!

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(10.12.2016)