химический каталог




Химия протеолиза

Автор В.К.Антонов

it . ш

8.7. "Идеальный" фермент

371

чается во флуктуационном изменении ориентации диполей макромолекулы белка и не сопровождается растяжением связи. Реорганизация среды активного центра приводит к перераспределению электронных уровней реагирующих атомов, причем переходному состоянию будут соответствовать примерно одинаковые электронные уровни. В этом состоянии возможен подбврьерный (туннельный) перенос протона.

Таким образом, вероятность элементарного акта реакции зависит от конфор-мационного состояния среды и электронного состояния активного центра фермента :

а,а' п.п'

Ф W а., п а,а

(26)

где Фа п - вероятность того, что до реакции среда характеризуется конформа-ционным состоянием а и электронным состоянием п, a wa а, - вероятность петь, п*

рехода системы в состояния а' и п'. Общий результат электронно-конформаци-онных взаимодействий заключается в том, что электронная перестройка в ходе реакции влечет за собой изменение конформации макромолекулы. Трактовка этих явлений на языке теории твердого тела привела (3433) к введению представления о существовании квазичастицы "конформона" (по аналогии с поляроном), включающей электрон и деформацию макромолекулы, энергия которой меньше, чем энергия свободного электрона. Вследствие этого понижается и барьер реакции.

Эти представления согласуются с так называемым принципом компенсации (дополнительности) (1375], согласно которому изменение конформационной энергии по координате реакции является дополнительным к изменениям химической свободной энергии, вследствие чего суммарное изменение оказывается "сглаженным".

• Детальное описание этих представлений с привлечением математического аппарата квантовой механики выходит за рамки наших задач и содержится в цитированных выше работах.

8.7. "Идеальный" фермент

Изложенное выше показывает, что каталитическое действие фермента может быть, в принципе, обусловлено сродством фермента к субстрату на разных стадиях процесса. Учитывая сродство продукта реакции к ферменту, можно различить (3348,3434] три типа фермент-субстратных взаимодействий (рис.133) -униформное связывание, когда фермент не дискриминирует субстрат, переходное состояние и продукт и связывает все эти формы практически одинаково, дифференциальное связывание, когда фермент различным образом связывает субстрат и продукт, и связывание (катализ) элементарных стадий, когда фермент связывает переходное состояние более прочно, чем субстрат и продукт. В первом случае оптимальный катализ будет наблюдаться при равенстве активационных барьеров переходного состояния и диссоциации комплекса фермент-продукт (а=Ь). Во втором случае.каталитическая эффективность оказывается максимальной при равенстве уровней свободной энергии комплексов ES и ЕР, т.е. когда равновесие между "внутренними" комплексами близко к единице. Наконец, "иде-

372

Глава восьмая. Специфичность и эффективность. Теории и гипотезы

E-TS

E+S Е•S Е-Р Е+Р

Рис.133. Иллюстрация трех типов изменений свободной энергии по координате реакции при ферментативном катализе [3348]

А - униформное связывание, Б - дифференциальное связывание, В - связывание (катализ) элементарных стадий (см. текст)

альный" фермент с наименьшими энергетическими барьерами будет в случае, когда стабилизируется переходное состояние. Следует подчеркнуть, что термодинамический анализ этих случаев справедлив, если в качестве стандартного состояния выбраны реальные концентрации субстрата, существующие In vivo. По-видимому, существуют ферменты, отвечающие каждому из перечисленных типов связывания [3348]. Примером "идеального" фермента может служить 6-лак-тамаза [3435]. Количественный анализ этих случаев и условия равенства свободных энергий "внутренних" стадий дан в работе (3436].

8.8. Основное состояние элементарного акта ферментативной и модельной реакций

Ферментативный процесс - многостадийная реакция, реализующаяся посредством серии последовательных элементарных актов. Каждый акт в той или иной степени изменяет состояние субстрата, и поэтому основное состояние лишь самого первого элементарного акта идентично основному состоянию в модельной конгруэнтной системе. Сравнение активационных барьеров последующих элементарных г.тов ¦ ¦ ктявв 'ют ж "рьерами неферментативной реакции возможно .шшь при

8.9. Фермент не понижает энергию активации элементарного акта 373

Рассмотренные выше теории и гипотезы прямо или косвенно игнорируют это обстоятельство. Так, трудности, возникающие при попытках объяснения эффективности и специфичности ферментов дестабилизацией основного состояния фермент-субстратного комплекса, возникают в основном в силу того, что барьер химической стадии в отсутствие дестабилизации признается равным барьеру химической стадии неферментативного процесса. Это понятно, так как исключая какой-либо фактор, влияющий на скорость реакции, мы тем самым считаем, что в отсутствие этого фактора скорости сравниваемых процессов должны быть одинаковы. Далее, сравнивая скорости превращения дестабилизированного на ферменте субстрата с неферментативной реакцией, в качестве основного состояния для последней выбирают состояние субстрата в отсутствие каких-либо дестабилизирующих, факторов. Таким образом, сопоставляются два элементарных акта, имеющих различные основные состояния. Очевидно, что для того, чтобы оценить понижение активационного барьера элементарного акта химической стадии (и любой другой), нужно выбирать одинаковые основные состояния реагирующих веществ.

Это можно формализовать следующим образом. Если на ферменте субстрат находится в состоянии Sa, то можно себе представить, что в растворе имеется некоторая доля молекул, находящихся в том же состоянии, т.е. существует равновесие

Кп (SJ 5эт > П » S . где К = —— «1. (27)

п a n [S ]

п

Формы Sn и Sa могут обладать совершенно разной реакционной способностью. Для простоты можно полагать, что реакция происходит только с молекулами активной формы (S ) с константой скорости ka. Тогда наблюдаемая скорость превращения всего субстрата будет:

v = к К LS] . (28)

п an о

Следовательно, выбор одинакового основного состояния означает, что при сравнении активационных барьеров ферментативной и неферментативной реакций должны сравниваться константа ка для неферментативного процесса и константа скорости соответствующей стадии каталитической реакции.

8.9. Фермент не понижает энергию активации элементарного акта химической реакции

Предлагаемая в этом разделе концепция сформулирована автором совместно с М.Я.Карпейским и Г.М.Яковлевым (3437]. Она использует многие идеи, изложенные выше, и развивает представления, высказанные в работах L1715.3438]. Основные положения этой концепции заключаются в следующем: а) фермент не понижает свободную энергию активации элементарного акта химического превращения субстрата, если в качестве основного состояния выбираются идентичные для катализируемой и некатализируемой реакций состояния субстрата; б) фермент стабилизирует термодинамически невыгодное в растворе, но реакционно-способное состояние субстрата, образуя с ним продуктивный фермент-субстрат-

374

Глава восьмая. Специфичность и эффективность. Теории и гипотезы

ный комплекс; в) образование продуктивного фермент-субстратного комплекса происходит ступенчато, так что на каждой стадии процесса фермент комплементарен структуре субстрата. Каждая стадия протекает в оптимальных условиях, создающихся в результате завершения предыдущей стадии (см.: (3438]).

8.9.1. Описание модели

Рассмотрим подробнее процесс фермент-субстратного взаимодействия (рис.134). Как уже отмечалось в предыдущем разделе, для субстрата в растворе всегда можно найти состояние, максимально близкое по структуре и распределению электронной плотности к состоянию, которое он имеет в продуктивном фермент-субстратном комплексе. Это состояние (Sa) находится в равновесии с "неактивной" формой (Sn), причем равновесие сдвинуто в сторону последней (К «1). Особенности этого состояния применительно к реакциям, катализируемым амид-гидролазами, обсуждаются в разд.8.10.

На первой стадии каталитического процесса обе формы субстрата способны связываться с ферментом, давая неспецифический сорбционный комплекс (EQSn и EQSa), причем константы ассоциации обеих форм субстрата с ферментом практически одинаковы. Этот комплекс образуется за счет столкновения молекулы субстрата с активным центром фермента, и система теряет при этом трансляционные степени свободы. Однако вращение вокруг одинарных связей фрагментов молекулы субстрата и функциональных групп активного центра фермента остается незаторможенным, т.е. субстрат может быть ориентирован относительно белка различным образом. Уменьшение энтропии вследствие комплексообразования может компенсироваться вытеснением молекул воды, составляющих гидратную оболочку взаимодействующих с белком фрагментов субстрата и молекул, иммобилизованных в активном центре фермента.

Строение сорбционного комплекса характеризуется подвижностью его компонентов, т.е. в нем осуществляются не все потенциально возможные контакты между субстратом и ферментом. При образовании этого комплекса реализуется первый уровень специфичности фермента (первичная специфичность).

На второй стадии происходит фиксация сорбционного комплекса в конформации, обеспечивающей возможность взаимодействия реагирующего фрагмента молекулы субстрата с группами активного центра фермента. Образуются так называемые фиксированные комплексы EpSn и EpSa. При этом реализуется максимально возможное число взаимодействий между нетрансформируемыми фрагментами молекулы субстрата и белком, обусловленные топохимическим соответствием реагентов. На этой стадии проявляется вторичная специфичность ферментов. На этой стадии проявляется вторичная специфичность ферментов.

Для простоты изложения можно принять, что вклад в свободную энергию фиксированного комплекса, обусловленный взаимодействием реагирующего фрагмента молекулы субстрата с белком, равен нулю. Следовательно, здесь еще не происходит стабилизации активной формы субстрата. Это происходит на следующей стадии образования продуктивного комплекса (EpS*). Стабилизация активной формы субстрата может происходить как за счет образования новых связей реагирующего фрагмента с группами белка, так и благодаря топохимическому соответствию этого фрагмента активной формы субстрата активному центру бежа. Смысл стабилизации активной формы заключается в способности фермента диск-

8.9. Фермент не понижает энергию активации элементарного акта 375

Неактивная форма Активная форма субстрати 5п -субстратаt Sa

E+S

Фиксированный \df комплекс

(EpS) W ^s,

Продуктивный комплекс

A e

Рис.134. Модель ферментативной реакции (а) [3437] и соответствующий ей энергетический профиль (б) (образование комплекса Е S опущено) р "

Г и R - группы субстрата, определяющие соответственно первичное и вторичное связывание; N и А - неактивное и активное состояния реагирующей группы субстрата соответственно; 1 и 2 - участки фермента, определяющие первичную и вторичную специфичность; 3 - каталитический участок фермента

риминировать состояние реагирующего фрагмента активной и неактивной форм субстрата и образовывать с первой более прочный комплекс. Таким образом, фермент на стадии образования продуктивного комплекса комплементарен основному состоянию активной формы субстрата.

Следует подчеркнуть, что такое рассмотрение является в значительной степени условным, и продуктивный фермент-субстратный комплекс может образовываться из комплекса с неактивной формой (EpSn) путем изомеризации последнего (EpSn—* EpS*). В общем случае различие в строении и свойствах реагирующего фрагмента молекулы субстрата в его разных формах обусловлено особенностью строения всей молекулы. Изомеризация EpSn —*- EpS* происходит потому, что топохимическое соответствие между неактивной формой субстрата и ферментом достаточно только для образования комплекса EpSn, тогда как условием образования EpS* является трансформация Sn^»- S^.

8.9.2. Кинетическое рассмотрение модели

Как уже было показано в предыдущем разделе, превращение субстрата в растворе можно представить как

К k (S ]

па а

S «——«- 55 -> Р, где К - -— «1 .

л а П |я 1

376

Глава восьмая. Специфичность и эффективность. Теории и гипотезы

Тогда v=k К (S1 или v=k (S) , где к =к К - наблюдаемая константа ско-

а п о по пап

рости неферментативной реакции.

Ферментативная реакция происходит в соответствии с предлагаемой моделью по схеме:

*i кг кз кл л кв

Е + S ,-* Е S -* Е S —* Е S - Е S -* Е + Р. (29)

п k ° п к р п к р а к п а

Поскольку стабилизация формы Sa ферментом происходит только на стадии к., равновесие между комплексами Е S и Е S не зависит от фермента, и по-

4 с р п р а

этому к3/к_3-Кп. Существует, конечно, и параллельный путь, начинающийся с взаимодействия свободного фермента с активной формой субстрата и приводящий к комплексу Е S , однако, так как (S )«(S ], этот путь можно не рассматри-вать.

При условии, что все равновесия устанавливаются быстрее, чем происходит химическое превращение субстрата, скорость ферментативной реакции можно представить формулой:

К КЛЕ1 (S) 5 р п Q о о

(30)

К + И+К (1+К iTJ]-t-[Sl s р п Q о

й-1 кг кл

где К = -, К = - и Кп = -.

3 ъ р ъ Q k

Экспериментально определяемые кинетические параметры будут:

fc.K К КЛЕ) (SI

5 р п Q о о

к + = -, (31)

cat 1+К (1+К КЛ р п Q

К' =---, (32)

m 1+К (1+К К_)

р n Q'

k кЛ. К К-

cat Ъ р п Q

- = -. (33)

К' к

m з

В том случае, если химическая стадия не лимитирует общую скорость процесса, выражение для скорости реакции имеет довольно сложный вид и неудобно для анализа. Однако из него следует, что ft принимает значение константы скорости одной (наиболее медленной) стадии или является комбинацией констант скорости нескольких стадий, a становится равной Кд.

Эффективность ферментативного катализа может быть выражена как отношение k Jk или как отношение k vK'fc . Из формул (31) и (33) и значения

cat n cat m п * Г

к - к К (учитывая, что к -&_) имеем:

n а п J а 5

к + К Кп

cat р Q

__, _ ^ . 34 ,

ft 1+К (1+К КЛ'

?. р n Q

8.9. Фермент не понижает энергию активации элементарного акта 377

cat

k К'

п m

Р Q

(35)

В разд.8.10 мы попытаемся оценить значения К и Значение К может в

П Q р

принципе быть больше или меньше единицы в зависимости от того, достаточен ли вклад вторичных взаимодействий, чтобы превысить потери, связанные с замораживанием вращательных степеней свободы. При Кр»1 и KnKQ<1 йса1/*п=кс2' а если К K^>1, то ft Jk =1 /К . В то же время если К «1, то ft Jk будет

n Q cat п п r р cat п л"

равно соответственно К К„ или 1/К .

г р Q п

Стюцьфачностъ, т.е. отношение кинетических констант в серии субстратов, обычно оценивают по отношению констант скорости второго пор

страница 58
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Химия протеолиза" (8.49Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
детские футбольные ворота
Светодиодная подсветка салона автомобиля
набор посуды zwilling
отучиться на педикюр

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(03.12.2016)