![]() |
|
|
Химия протеолизамента в катализе. Кроме того, представление об индуцированном соответствии хорошо применимы для объяснения аллостерии. В модели Кошланда-Немети-Филмера (34081 субъединичный белок в отсутствие лигандов существует в одной конформации, а при связывании лиганда последний индуцирует конформационные изменения, передающиеся на другую субъединицу. Эта модель хорошо объясняет особенности связывания кислорода гемоглобином. 8.4. Стабилизация переходного состояния Как мы убедились, ни одна из рассмотрены^ выше теорий не объясняет понижения активационного барьера ферментативной реакции ) по отношению к барьеру неферментативного процесса, если считать, что обе реакции идут через одно и то же переходное состояние. Рассмотренные механизмы лишь изменяют уровень основного состояния ферментативной реакции. Очевидно, что ис 366 Глава восьмая. Специфичность и эффективность. Теории и гипотезы Рис.131. Энергетический профиль реакции при условии комплементарное™ фермента переходному состоянию субстрата кать объяснения эффективности и специфичности ферментов необходимо на пути, рассматривающем переходные состояния ферментативной и неферментативной реакций как различные. Представим себе [16131, что субстрат, связываясь с ферментом, реализует лишь часть возможных взаимодействий вследствие того, что фермент некомплементарен основному состоянию субстрата (см. разд.8.2). Комплементарность достигается лишь в переходном состоянии, и при этом субстрат реализует еще не использованные возможности связи с ферментом. При этом, как видно из рис.131, уровень свободной энергии основного состояния увеличивается по сравнению с уровнем полной комплементарное™ на некоторую величину aGr, а уровень свободной энергии переходного состояния уменьшается на ту же величину. Чтобы оценить эффективность катализа, обратимся вновь к схеме 1. В рассматриваемом случае величины aGbs и aG*s (aGE3. и aGJs.) можно представить как: до. uGtot - AGR И дО ЕЗ' ES дой, (21 ) (22) где AG t - полная энергия фермент-субстратного взаимодействия. В соответствии с равенством (2) можно записать, что: до? = дС* aG„ (23) "ES' ""ES1 ""S " T' Подставляя сюда выражения (21) и (22) к учитывая, что по-прежнему дС*д=дО*. получим: (23) Таким образом, понижение энергии переходного состояния ферментативной реакции по сравнению с конгруэнтной модельной реакцией будет равно полной энергии фермент-субстратного взаимодействия. Оценки этой энергии для производных ациламинокислот (см. разд. 6.6) дают значения, доходящие до 25 ккал/моль. Это с избытком покрывает все наблюдаемые различия в скоростях ферментативного и неферментативного гидролиза. Такой механизм в отличие от рассмотренных выше объясняет изменение константы скорости второго порядка как в ряду субстратов (специфичность), так и по отношению к конгруэнтной модели (эффективность). 8.4. Стабилизация переходного состояния Этот же результат можно получить из теории напряжений, если предположить, что напряжения, возникающие в основном состоянии, снимаются по достижении системой переходного состояния. Концепция стабилизации переходного состояния подкрепляется следующими аргументами: 1) оценки полной энергии фермент-субстратного взаимодействия обычно значительно превышают наблюдаемые (в Кд) изменения свободной энергии комплексообразования; 2) имеется много примеров, когда в серии субстратов изменяется каталитическая константа при практически постоянном значении Кд (см. разд.4.3.4). Наиболее характерным примером может служить катализируемый пепсином гидролиз пептидов, когда при переходе от да- к тетрапептидам Кт (равная в данном случае Кд) изменяется не более, чем в 10 раз, a fecat увеличивается в 105 раз; 3) направленный мутагенез групп, участвующих в связывании субстрата, часто влияет не на связывание (Кд), а на катализ №oat)- Особенно подробно такие работы проведены на примере тирозил-тРНК синтетазы (1613,3409-3411); 4) так называемые аналоги переходного состояния (см. разд.5.9.7) имеют, как правило, аномально низкие значения Kt. однако, как уже указывалось, трактовка этого факта не является однозначной. Применительно к катализу химотрипсином и некоторыми другими протеазами эти идеи были воплощены в виде экстракционно-конформационной модели их действия (см. обзор: (1963)). Экспериментальный факт, лежащий в основе этой модели, заключается в том, что для субстратов химотрипсина - эфиров W-ациламинокислот - изменение свободной энергии на стадиях ацилирования (AG*) и деацилирования (aG*) фермента соответствует изменению свободной энергии при переносе боковой цепи субстрата из воды в неполярное окружение (,aGrx): ag* = ag* » agr . (24) ? о ea: В то же время в бимолекулярном процессе из исходных реагентов №cat/#m) наблюдается соотношение: Это последнее соотношение показывает, что энергия гидрофобного взаимодействия используется как для образования комплекса фермента с субстратом, так и для понижения активационного барьера химической стадии, что и преде казывает теория стабилизации переходного состояния. Объяснение этого эффекта заключается в том, что в переходном состоянии вследствие конформационных изменений возникают добавочные гидрофобные взаимодействия, отсутствовавшие в основном состоянии фермент-субстратного комплекса (рис.132) (3350,3412). Кроме гидрофобных взаимодействий в стабилизации переходного состояния могут участвовать все те взаимодействия, о которых говорилось в разд.8.2, если только их эффективность в основном и переходном состояниях различается. В качестве иллюстрации таких взаимодействий можно указать на гидролио лимотрипсином дипептидов AcPheGlyNHg и A^PheAlaNH, 11]. Как ,же уквзыва лось внш~ Юм. ра8д.7.Ю), замена атома водорода на метальную группу (Gly • 368 Глава восьмая. Специфичность и эффективность. Теории и гипотезы Рис.132. Механизм возникновения дополнительных гидрофобных взаимодействий фермента с субстратом при образовании переходного состояния [3350, с.157] Ala) приводит к резкому увеличению скорости гидролиза, проявляющемуся в feoat> а не в ?т. Анализ рентгеноструктурных моделей фермента показал, что в основном состоянии.комплекса химотрипсина с аланиновым субстратом имеются неблагоприятные взаимодействия метальной группы с некоторыми группами белка, а при образовании тетраэдрического промежуточного соединения эти взаимодействия отсутствуют. Этот результат можно трактовать как в рамках представлений о стабилизации переходного состояния, так и в рамках теории напряжений, включающей стабилизацию переходного состояния как результат снятия напряжений основного состояния. Предполагается, что в стабилизации переходного состояния у сериновых протеаз основной вклад вносят водородные связи. Оценка энергии этого вклада дана в работе [34131. Предложены два механизма такой стабилизации: один [13301 предполагает участие трех Н-связей, образуемых переходным состоянием и отсутствующих в комплексе Михаэлиса. Это связи, образуемые карбонильным 0-атомом с NH-группами Ser195 и Gly193, и связь ациламиногруппы субстрата с карбонилом Ser214. Электростатическое поле, создаваемое ионной парой Aspi02-H1S57, возможно стабилизирует тетраэдрическое переходное состояние у сериновых протеаз [3190,32571. Другой механизм [2011,34141 предполагает наличие этих связей как в комплексе Михаэлиса, так и в переходном состоянии, и эти связи не вносят вклада в энтальпию активации реакции, однако существенно изменяют энтропию переходного состояния. Были получены экспериментальные подтверждения этого второго механизма [34151. Теория стабилизации переходного состояния наиболее полно согласуется с экспериментальными данными, но и она встречается с серьезными трудностями. Наиболее существенная из них следующая: стабилизация переходного состояния требует, чтобы в этом состоянии возникали новые взаимодействия между ферментом и субстратом, отсутствовавшие в основном состоянии фермент-субстратного комплекса. Это означает, что образование переходного состояния должно сопровождаться или конформационными изменениями фермента [19631 или, по крайней мере, переориентацией ряда групп фермента. Однако образование переходного состояния, т.е. элементарный акт реакции, - флуктуация, происходящая за 10_1?-1О-13 с [3416]. За это время соударяющиеся частицы не успевают обменяться энергией, и полная энергия атомов остается неизменной на протяжении элементарного акта. Очевидно, что конформационные изменения белка, происходящие со скоростями порядка 10б-1О4 с-1, никак не могут совершаться в течение элементарного акта. 8.5. Фермент - "машина" 369 Можно предположить, что ответственные за стабилизацию переходного состояния группы как бы "осциллируют" между двумя состояниями, и если элементарный акт происходит в момент благоприятного для стабилизации переходного состояния положения групп, то переходное состояние стабилизируется. Но и в этом случае несогласование временных интервалов процессов делает, по моему мнению, вероятность стабилизации весьма малой. Влияние факторов синхронизации на скорость процесса можно оценить по формулам, приведенным в разд.3.4.8. Для образования трех водородных связей необходимо синхронное движение не менее шести тяжелых атомов, что резко снизит скорость процесса даже при энергии активации Е^^икТ. Далее, стабилизация переходного состояния фактически предусматривает использование энергии дестабилизации основного состояния (или энергии напряжения). Иначе говоря, выигрыш энергии и ее расходование происходят на разных стадиях процесса. Это требует формулирования каких-то механизмов "запасания" энергии в ходе каталитического акта. Такой механизм был предложен в работах (3417,3418), в которых белковая молекула рассматривалась как твердое тело, неоднородное по "плотности". Наименьшая "плотность" приписывалась области активного центра. В этой модели энергия сорбции субстрата запасается глобулой белка в виде упругих деформаций и "стекает" в область актибного центра бездиссипативным путем в виде большого числа когерентных по частоте и фазе фононов. Вопрос о правомерности моделирования белка упругим твердым телом остается открытым. Наконец, трудно объяснить в рамках этой модели постоянство величин Кд в сериях субстратов, сильно отличающихся по числу возможных контактов с ферментом (например, субстраты пепсина). Почему практически постоянная часть полной энергии взаимодействия реализуется в наблюдаемых значениях Кд? Кажется, логичнее предположить, что чем больше полная энергия взаимодействия субстрата с ферментом в основном состоянии, тем меньшая часть должна использоваться на стадии переходного состояния. Собственно, такой механизм и наблюдается для эфиров ациламинокислот - субстратов химотрипсина, где как Кд, так и &cat пропорциональны гидрофобности боковой цепи. Однако, у пептидных субстратов этого не наблюдается. 8.5. Фермент - "машина" В работах (г450,3419-34гг) была проанализирована применимость теории активированного комплекса к реакциям с участием биополимеров. Был сформулирован вывод, в соответствии с которым теория активированного комплекса и ее эмпирические предшественники (уравнения Аррениуса и Вант-Гоффа) неприменимы к таким реакциям и, возможно, даже неприменимы к реакциям в конденсированной фазе. Это обусловлено, главным образом, тем, что любая тепловая флуктуация приводит к изменению структуры "среды" - фермента, его "конструкции". Следствием этого является возникновение кинетической неравновесности в ходе процесса, и тогда бессмысленно говорить о комплементарное™ и существовании активационного барьера. Изменение последнего связано с конформационными и конфигурационными превращениями макромолекулы, а собственно химическое превращение с ростом числа богатых энергией молекул, т.е. с явлением, не связанным с состоянием макромолекулы. Макромолекула фермента - фактически 370 Глава восьмая. Специфичность и эффективность. Теории и гипотезы своеобразная машина, в которой пространственно совмещены механические и статистические компоненты. Такая машина обладает выделенными степенями свободы и способна использовать внутреннюю энергию для совершения полезной работы. Эти соображения позволили предложить релаксационную концепцию ферментативного катализа, согласно которой конформационные изменения фермент-субстратного комплекса, индуцированные присоединением субстрата, носят характер релаксации и сопровождаются химическим превращением молекулы субстрата. В соответствии с этой гипотезой присоединение субстрата вызывает локальные, очень быстрые (за времена колебательной релаксации 10~1г-10-13 с) изменения в геометрии и электронной структуре активного центра. При этом субстрат и его окружение оказываются в новом равновесном состоянии, тогда как вся глобула продолжает оставаться в прежнем состоянии. Это ведет к возникновению стерических напряжений. Релаксация всей макромолекулы к новому состоянию происходат за времена порядка миллисекунд, и именно на данной стадии происходит каталитическое превращение субстрата. Эта концепция не противоречит некоторым экспериментальным данным, касающимся процессов переноса электрона (см., например: (34231), хотя она вряд ли применима для объяснения эффективности и специфичности гидролитических ферментов. В частности, в соответствии с релаксационной гипотезой вблизи положения равновесия константы скорости релаксационных стадий должны уменьшаться. Вместе с тем данные по скоростям изотопного обмена в состоянии равновесия для реакций, катализируемых пепсином [1732] и химотрипсином (17311, не согласуются с этим предсказанием. Скорость превращения ES в ЕР измерялась в реакциях, катализируемых пиру-ваткиназой (34241 в стационарных условиях и условиях равновесия. Были получены одинаковые значения. По мнению авторов (34241, фермент увеличивает популяцию колебательно-возбужденных состояний фермент-субстратного комплекса, не изменяя потенциальной поверхности реакции. Остаются неясными движущие силы химического превращения. Обычно связь субстрата с ферментом достаточно слаба, тогда как разрыв химической связи требует больших энергетических затрат. Наконец, гидролитические реакции начинаются не с разрыва связи, а с ее образования (атака атома кислорода на карбонильный углерод). Релаксационную концепцию, по-моему, трудно применить к таким процессам. Представление о наличии у ферментов выделенных "конструктивных" (механических) степеней свободы разрабатывалось также и другими исследователями (3417,34251. Механизм работы фермента трактовался в них как следствие кон-формационной неравновесности фермента и фермент-субстратного комплекса, возникающей после осуществления первого акта превращения субстрата и сохраняющейся без диссипации энергии до следующего акта катализа. 8.6. Квантово-химическое описание ферментативных реакций Квантово-химическая теория окислительно-восстановительных реакций [3426] была распространена (34271 на реакции, протекающие с разрывом химических связей, и в дальнейшем - на ферментативные процессы (3384,3395,3428-34321. В основе этих представлений лежит мысль с т м, ;- |
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 |
Скачать книгу "Химия протеолиза" (8.49Mb) |
[каталог] [статьи] [доска объявлений] [прайс-листы] [форум] [обратная связь] |
|
Введение в химию окружающей среды. Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей
среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги
заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в
разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности.
Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и
атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на
химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах.
Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии
университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга
читателей.
Химия и технология редких и рассеянных элементов. Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов
химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии
лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во
второй
части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана,
лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В
третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия,
тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание
уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В
технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика
рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов
производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие
составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по
1972 год включительно.
|
|