мента в катализе.

Кроме того, представление об индуцированном соответствии хорошо применимы для объяснения аллостерии. В модели Кошланда-Немети-Филмера (34081 субъединичный белок в отсутствие лигандов существует в одной конформации, а при связывании лиганда последний индуцирует конформационные изменения, передающиеся на другую субъединицу. Эта модель хорошо объясняет особенности связывания кислорода гемоглобином.

8.4. Стабилизация переходного состояния

Как мы убедились, ни одна из рассмотрены^ выше теорий не объясняет понижения активационного барьера ферментативной реакции ) по отношению к барьеру неферментативного процесса, если считать, что обе реакции идут через одно и то же переходное состояние. Рассмотренные механизмы лишь изменяют уровень основного состояния ферментативной реакции. Очевидно, что ис

366

Глава восьмая. Специфичность и эффективность. Теории и гипотезы

Рис.131. Энергетический профиль реакции при условии комплементарное™ фермента переходному состоянию субстрата

кать объяснения эффективности и специфичности ферментов необходимо на пути, рассматривающем переходные состояния ферментативной и неферментативной реакций как различные.

Представим себе [16131, что субстрат, связываясь с ферментом, реализует лишь часть возможных взаимодействий вследствие того, что фермент некомплементарен основному состоянию субстрата (см. разд.8.2). Комплементарность достигается лишь в переходном состоянии, и при этом субстрат реализует еще не использованные возможности связи с ферментом.

При этом, как видно из рис.131, уровень свободной энергии основного состояния увеличивается по сравнению с уровнем полной комплементарное™ на некоторую величину aGr, а уровень свободной энергии переходного состояния уменьшается на ту же величину.

Чтобы оценить эффективность катализа, обратимся вновь к схеме 1. В рассматриваемом случае величины aGbs и aG*s (aGE3. и aGJs.) можно представить как:

до.

uGtot - AGR И

дО

ЕЗ'

ES

дой,

(21 ) (22)

где AG t - полная энергия фермент-субстратного взаимодействия. В соответствии с равенством (2) можно записать, что:

до?

= дС*

aG„

(23)

"ES' ""ES1 ""S " T'

Подставляя сюда выражения (21) и (22) к учитывая, что по-прежнему дС*д=дО*. получим:

(23)

Таким образом, понижение энергии переходного состояния ферментативной реакции по сравнению с конгруэнтной модельной реакцией будет равно полной энергии фермент-субстратного взаимодействия. Оценки этой энергии для производных ациламинокислот (см. разд. 6.6) дают значения, доходящие до 25 ккал/моль. Это с избытком покрывает все наблюдаемые различия в скоростях ферментативного и неферментативного гидролиза.

Такой механизм в отличие от рассмотренных выше объясняет изменение константы скорости второго порядка как в ряду субстратов (специфичность), так и по отношению к конгруэнтной модели (эффективность).

8.4. Стабилизация переходного состояния

Этот же результат можно получить из теории напряжений, если предположить, что напряжения, возникающие в основном состоянии, снимаются по достижении системой переходного состояния.

Концепция стабилизации переходного состояния подкрепляется следующими аргументами: 1) оценки полной энергии фермент-субстратного взаимодействия обычно значительно превышают наблюдаемые (в Кд) изменения свободной энергии комплексообразования; 2) имеется много примеров, когда в серии субстратов изменяется каталитическая константа при практически постоянном значении Кд (см. разд.4.3.4). Наиболее характерным примером может служить катализируемый пепсином гидролиз пептидов, когда при переходе от да- к тетрапептидам Кт (равная в данном случае Кд) изменяется не более, чем в 10 раз, a fecat увеличивается в 105 раз; 3) направленный мутагенез групп, участвующих в связывании субстрата, часто влияет не на связывание (Кд), а на катализ №oat)- Особенно подробно такие работы проведены на примере тирозил-тРНК синтетазы (1613,3409-3411); 4) так называемые аналоги переходного состояния (см. разд.5.9.7) имеют, как правило, аномально низкие значения Kt. однако, как уже указывалось, трактовка этого факта не является однозначной.

Применительно к катализу химотрипсином и некоторыми другими протеазами эти идеи были воплощены в виде экстракционно-конформационной модели их действия (см. обзор: (1963)).

Экспериментальный факт, лежащий в основе этой модели, заключается в том, что для субстратов химотрипсина - эфиров W-ациламинокислот - изменение свободной энергии на стадиях ацилирования (AG*) и деацилирования (aG*) фермента соответствует изменению свободной энергии при переносе боковой цепи субстрата из воды в неполярное окружение (,aGrx):

ag* = ag* » agr . (24) ? о ea:

В то же время в бимолекулярном процессе из исходных реагентов №cat/#m) наблюдается соотношение:

Это последнее соотношение показывает, что энергия гидрофобного взаимодействия используется как для образования комплекса фермента с субстратом, так и для понижения активационного барьера химической стадии, что и преде казывает теория стабилизации переходного состояния.

Объяснение этого эффекта заключается в том, что в переходном состоянии вследствие конформационных изменений возникают добавочные гидрофобные взаимодействия, отсутствовавшие в основном состоянии фермент-субстратного комплекса (рис.132) (3350,3412).

Кроме гидрофобных взаимодействий в стабилизации переходного состояния могут участвовать все те взаимодействия, о которых говорилось в разд.8.2, если только их эффективность в основном и переходном состояниях различается.

В качестве иллюстрации таких взаимодействий можно указать на гидролио лимотрипсином дипептидов AcPheGlyNHg и A^PheAlaNH, 11]. Как ,же уквзыва лось внш~ Юм. ра8д.7.Ю), замена атома водорода на метальную группу (Gly •

368

Глава восьмая. Специфичность и эффективность. Теории и гипотезы

Рис.132. Механизм возникновения дополнительных гидрофобных взаимодействий фермента с субстратом при образовании переходного состояния [3350, с.157]

Ala) приводит к резкому увеличению скорости гидролиза, проявляющемуся в feoat> а не в ?т. Анализ рентгеноструктурных моделей фермента показал, что в основном состоянии.комплекса химотрипсина с аланиновым субстратом имеются неблагоприятные взаимодействия метальной группы с некоторыми группами белка, а при образовании тетраэдрического промежуточного соединения эти взаимодействия отсутствуют. Этот результат можно трактовать как в рамках представлений о стабилизации переходного состояния, так и в рамках теории напряжений, включающей стабилизацию переходного состояния как результат снятия напряжений основного состояния.

Предполагается, что в стабилизации переходного состояния у сериновых протеаз основной вклад вносят водородные связи. Оценка энергии этого вклада дана в работе [34131. Предложены два механизма такой стабилизации: один [13301 предполагает участие трех Н-связей, образуемых переходным состоянием и отсутствующих в комплексе Михаэлиса. Это связи, образуемые карбонильным 0-атомом с NH-группами Ser195 и Gly193, и связь ациламиногруппы субстрата с карбонилом Ser214. Электростатическое поле, создаваемое ионной парой Aspi02-H1S57, возможно стабилизирует тетраэдрическое переходное состояние у сериновых протеаз [3190,32571. Другой механизм [2011,34141 предполагает наличие этих связей как в комплексе Михаэлиса, так и в переходном состоянии, и эти связи не вносят вклада в энтальпию активации реакции, однако существенно изменяют энтропию переходного состояния. Были получены экспериментальные подтверждения этого второго механизма [34151.

Теория стабилизации переходного состояния наиболее полно согласуется с экспериментальными данными, но и она встречается с серьезными трудностями.

Наиболее существенная из них следующая: стабилизация переходного состояния требует, чтобы в этом состоянии возникали новые взаимодействия между ферментом и субстратом, отсутствовавшие в основном состоянии фермент-субстратного комплекса. Это означает, что образование переходного состояния должно сопровождаться или конформационными изменениями фермента [19631 или, по крайней мере, переориентацией ряда групп фермента. Однако образование переходного состояния, т.е. элементарный акт реакции, - флуктуация, происходящая за 10_1?-1О-13 с [3416]. За это время соударяющиеся частицы не успевают обменяться энергией, и полная энергия атомов остается неизменной на протяжении элементарного акта. Очевидно, что конформационные изменения белка, происходящие со скоростями порядка 10б-1О4 с-1, никак не могут совершаться в течение элементарного акта.

8.5. Фермент - "машина"

369

Можно предположить, что ответственные за стабилизацию переходного состояния группы как бы "осциллируют" между двумя состояниями, и если элементарный акт происходит в момент благоприятного для стабилизации переходного состояния положения групп, то переходное состояние стабилизируется. Но и в этом случае несогласование временных интервалов процессов делает, по моему мнению, вероятность стабилизации весьма малой.

Влияние факторов синхронизации на скорость процесса можно оценить по формулам, приведенным в разд.3.4.8. Для образования трех водородных связей необходимо синхронное движение не менее шести тяжелых атомов, что резко снизит скорость процесса даже при энергии активации Е^^икТ.

Далее, стабилизация переходного состояния фактически предусматривает использование энергии дестабилизации основного состояния (или энергии напряжения). Иначе говоря, выигрыш энергии и ее расходование происходят на разных стадиях процесса. Это требует формулирования каких-то механизмов "запасания" энергии в ходе каталитического акта.

Такой механизм был предложен в работах (3417,3418), в которых белковая молекула рассматривалась как твердое тело, неоднородное по "плотности". Наименьшая "плотность" приписывалась области активного центра. В этой модели энергия сорбции субстрата запасается глобулой белка в виде упругих деформаций и "стекает" в область актибного центра бездиссипативным путем в виде большого числа когерентных по частоте и фазе фононов. Вопрос о правомерности моделирования белка упругим твердым телом остается открытым.

Наконец, трудно объяснить в рамках этой модели постоянство величин Кд в сериях субстратов, сильно отличающихся по числу возможных контактов с ферментом (например, субстраты пепсина). Почему практически постоянная часть полной энергии взаимодействия реализуется в наблюдаемых значениях Кд? Кажется, логичнее предположить, что чем больше полная энергия взаимодействия субстрата с ферментом в основном состоянии, тем меньшая часть должна использоваться на стадии переходного состояния. Собственно, такой механизм и наблюдается для эфиров ациламинокислот - субстратов химотрипсина, где как Кд, так и &cat пропорциональны гидрофобности боковой цепи. Однако, у пептидных субстратов этого не наблюдается.

8.5. Фермент - "машина"

В работах (г450,3419-34гг) была проанализирована применимость теории активированного комплекса к реакциям с участием биополимеров. Был сформулирован вывод, в соответствии с которым теория активированного комплекса и ее эмпирические предшественники (уравнения Аррениуса и Вант-Гоффа) неприменимы к таким реакциям и, возможно, даже неприменимы к реакциям в конденсированной фазе. Это обусловлено, главным образом, тем, что любая тепловая флуктуация приводит к изменению структуры "среды" - фермента, его "конструкции". Следствием этого является возникновение кинетической неравновесности в ходе процесса, и тогда бессмысленно говорить о комплементарное™ и существовании активационного барьера. Изменение последнего связано с конформационными и конфигурационными превращениями макромолекулы, а собственно химическое превращение с ростом числа богатых энергией молекул, т.е. с явлением, не связанным с состоянием макромолекулы. Макромолекула фермента - фактически

370

Глава восьмая. Специфичность и эффективность. Теории и гипотезы

своеобразная машина, в которой пространственно совмещены механические и статистические компоненты. Такая машина обладает выделенными степенями свободы и способна использовать внутреннюю энергию для совершения полезной работы.

Эти соображения позволили предложить релаксационную концепцию ферментативного катализа, согласно которой конформационные изменения фермент-субстратного комплекса, индуцированные присоединением субстрата, носят характер релаксации и сопровождаются химическим превращением молекулы субстрата.

В соответствии с этой гипотезой присоединение субстрата вызывает локальные, очень быстрые (за времена колебательной релаксации 10~1г-10-13 с) изменения в геометрии и электронной структуре активного центра. При этом субстрат и его окружение оказываются в новом равновесном состоянии, тогда как вся глобула продолжает оставаться в прежнем состоянии. Это ведет к возникновению стерических напряжений. Релаксация всей макромолекулы к новому состоянию происходат за времена порядка миллисекунд, и именно на данной стадии происходит каталитическое превращение субстрата.

Эта концепция не противоречит некоторым экспериментальным данным, касающимся процессов переноса электрона (см., например: (34231), хотя она вряд ли применима для объяснения эффективности и специфичности гидролитических ферментов. В частности, в соответствии с релаксационной гипотезой вблизи положения равновесия константы скорости релаксационных стадий должны уменьшаться. Вместе с тем данные по скоростям изотопного обмена в состоянии равновесия для реакций, катализируемых пепсином [1732] и химотрипсином (17311, не согласуются с этим предсказанием.

Скорость превращения ES в ЕР измерялась в реакциях, катализируемых пиру-ваткиназой (34241 в стационарных условиях и условиях равновесия. Были получены одинаковые значения. По мнению авторов (34241, фермент увеличивает популяцию колебательно-возбужденных состояний фермент-субстратного комплекса, не изменяя потенциальной поверхности реакции.

Остаются неясными движущие силы химического превращения. Обычно связь субстрата с ферментом достаточно слаба, тогда как разрыв химической связи требует больших энергетических затрат. Наконец, гидролитические реакции начинаются не с разрыва связи, а с ее образования (атака атома кислорода на карбонильный углерод). Релаксационную концепцию, по-моему, трудно применить к таким процессам.

Представление о наличии у ферментов выделенных "конструктивных" (механических) степеней свободы разрабатывалось также и другими исследователями (3417,34251. Механизм работы фермента трактовался в них как следствие кон-формационной неравновесности фермента и фермент-субстратного комплекса, возникающей после осуществления первого акта превращения субстрата и сохраняющейся без диссипации энергии до следующего акта катализа.

8.6. Квантово-химическое описание ферментативных реакций

Квантово-химическая теория окислительно-восстановительных реакций [3426] была распространена (34271 на реакции, протекающие с разрывом химических связей, и в дальнейшем - на ферментативные процессы (3384,3395,3428-34321. В основе этих представлений лежит мысль с т м, ;-