химический каталог




Химия протеолиза

Автор В.К.Антонов

,3395]. Он ведет себя не как классическая частица (с частотой u«M7ft«l -Ю-12 с-1), а как квантовая частица (с и»к277г). Это означает, что протон в определенных условиях способен к подбарьерному, туннельному переходу. Условием туннелирования является близость электронных термов атомов, между которыми происходит перенос протона (рис.125). Связы-

вание ферментом субстрата может приводить к реорганизации "среды" активного центра, т.е. к переориентации диполей, так что электронные уровни атомов, участвующих в переносе протона, будут выравниваться. Подбарьерный перенос протона будет при этом происходить существенно быстрее, чем соответствующий "классический" перенос. Это может увеличить эффективность катализа в тех случаях, когда перенос протона является лимитирующей скорость стадией. Исследования температурной зависимости кинетического изотопного эффекта растворителя в реакциях, катализируемых химотрипсином и трипсином (см. разд. 5.5), согласуются с этими представлениями.

8.3. Теории и гипотезы.

Дестабилизация основного состояния

Теории и гипотезы ферментативного катализа, основанные на представлениях о "дестабилизации" основного состояния, наиболее многочисленны и восходят еще к представлениям о катализе, сформулированным Фишером. Термин "дестабилизация" здесь означает повышение свободной энергии основного состояния, обусловленное любыми причинами, о которых будет сказано ниже.

Следует подчеркнуть, что все модели, основанные на дестабилизации основного состояния, прямо или косвенно исходят из представления о том, что ферментативная и модельная реакции идут через одно и то же переходное состояние.

8.3.1. Непродуктивное связывание

Еще в 1892 г. Тамман (3396] отмечал различие между ферментативным гидролизом и гидролизом под действием кислот, заключавшееся в избирательности пер-

Е

Рис.125. Перенос протона туннелированием при равенстве электронных термов атомов донора и акцептора

8.3. Теории и гипотезы. Дестабилизация основного состояния 359

вого и неизбирательности второго. Наиболее четко и обоснованно эти идеи были сформулированы Фишером [3397], предложившим известную концепцию "ключа и замка".

В соответствии с этой концепцией фермент имеет ограниченную область (называемую теперь активным центром) жесткой конфигурации, которая может связывать лишь субстрат, комплементарный ей по своей конфигурации (рис.126). Таким образом, фермент может связывать и превращать лишь вполне определенный субстрат или группу очень сходных веществ. Фактически эффективность фермента связывалась с комплексообразованием так, как это обсуждалось с разд.8.1.

Рис.126. Иллюстрация концепции "ключ-замок" а- вид "сверку"; б- вид "сбоку"

Представления Фишера были затем развиты Бергманом и Фрутоном в их теории множественного сродства (3398) и в дальнейшем - Огстоном (3399]. Эти идеи известны под названием теории трехточечного связывания и позволили объяснить стереоспецифичность ферментов.

В 1950-х годах сложились представления о непродуктивном связывании [1717,3400-3402]. Они заключаются в том, что скорость ферментативной реакции зависит от того, насколько "правильно" связывается субстрат в активном центре. "Плохой" субстрат может эффективнее связываться "неправильно", затрудняя образование продуктивного фермент-субстратного комплекса:

К К fe

п р 2р ESn--=. Е + S t-» ESp -*¦ продукты, (6)

где Кр - константа ассоциации продуктивного комплекса (ES ), а Кп - константа ассоциации непродуктивного комплекса (ES^).

Эти представления были развиты Хейном и Ниманом в их "четырехзубой" (tetradental) модели специфичности химотрипсина [1718,3403,3404].

Согласно этой модели, фермент имеет четыре тетраэдрически расположенных локуса: р1, р2, р3 и рн, комплементарных замещающим группам субстрата в I-конфигурации (рис.127).

Локусы фермента р1, р2 и р3 акцептируют соответственно группы NHCOR', боковую цепь и расщепляемую связь субстрата, а локус р имеет "негативную

360

Глава восьмая. Специфичность и эффективность. Теории и гипотезы

Рз

1

р, . r'cohn^ 1 r , Р2

Рис.127. "Четырехзубая" модель взаимодействия субстрата в 1-конфигурации с активным центром химотрипсина

специфичность", т.е. не может связывать группы более объемные, чем протон.

В такой модели возможны 16 взаимодействий, приводящие к 12 комплексам. Из них продуктивными являются те, у которых реализуется правильное взаимодей-Относительная стабильность комплексов зависит от индивидуальных R-p-взаимодействий, причем важнейшее положение теории заключается в постулировании аддитивности всех взаимодействий.

Скорость ферментативной реакции в модели Хейна-Нимана описывается выражением (см. схему 6):

ствие с локусами р3 и рн

fe_ К

2р р

? ——пи нз]с р к

V =

(7)

1/й +(S] о с

где &2р - константа химического превращения продуктивного комплекса ESp;

К

константа ассоциации продуктивного комплекса;

К0 = Wn + EV сумма « р

констант ассоциации непродуктивных и продуктивных комплексов. Для каждого комплекса константа ассоциации в силу аддитивности равна произведению индивидуальных микроскопических констант R-p-взаимодействий:

К

и"

(8)

Микроскопические константы вследствие симметричности модели могут быть записаны в виде матрицы

*11 fe12 fe13 fe1H

fe21 fe22 кгз fe2H

k3Z кзз fe3H

*Н1 ^нг *нз *HH

(9)

где индексы 1, 2, 3 и H относятся к взаимодействиям R1, Р^, Н3 и Н с р1, рР- р3 и рн- В алгебраической форме этой матрицы положительные члены соответствуют константам ассоциации L-изомера субстрата, а отрицательные -константам ассоциации 1>-изомера. Микроскопические константы (табл.81) подбираются эмпирически и методом последовательных приближений добиваются выполнения условия (9). Этим методом были рассчитаны константы ассоциации не-

8*3. Теории и гипотезы. Дестабилизация основного состояния 361

Таблица 81. Микроскопические константы связывания соединений типа P^RpCHRg [3403]*

Заместитель I J=3 J =2 J=1 J=B.

Н н 0,826 0,826 0,826 0,826

CONHg 3 0,0371 0,007 0,037 0,479

СбН5СНг 2 1 ,22 72,9 0,84 0,282

и-Н0СсН„СН„ 6 4 2 2 1 ,08 63,3 0,649 0,301

3-1пс1СНг 2 60,8 340,2 24,6 0,136

сн3сош 1 3,67 0,727 0,788 0,400

а-С Н NCOHH 1 3,97 0,795 1 ,59 0,333

CICHgCONH 1 5,9 12,7 0,731 0,350

CP3C0NH 1 1,9 1,0 1,3 0,400

C,Hc00CC0NH 1 1 ,38 1,37 5,28 0,300

*Условия рН 7,9; 25°С; 0,1н. NaCl.

которых амидов N-ациламинокислот с химотрипсином.

Из формулы (7) следует, что каталитическая константа

cat

п р

(10)

В простейшем случае, если имеются лишь один продуктивный и один непродуктивный комплексы, выражение для ftcat будет:

К К гр р

ft.

' cat

(11)

К +к к

п р и

— + 1 К

Таким образом, когда превалирует продуктивное связывание (Кр»Кп), наблюдаемая каталитическая константа становится равной константе химического превращения продуктивного комплекса *cat-*2p-

Непродуктивные комплексы снижают эту величину на множитель К /К + К .

_ р тъ р

Легко показать, что Кп вносит вклад в свободную энергию основного состояния:

LG* . - (LG* + lG ) — lG

cat 2р р п

(12)

Из формулы (12) видно, что продуктивное связывание как бы "дестабилизи-

Глава восьмая. Специфичность и эффективность. Теории и гипотезы

Рис.128. Энергетический профиль ферментативной реакции, демонстрирующий роль непродуктивного связывания

1- AG =AG , AG* ^=AGZ;

p n cat 2

2- AG »AG , AG* .=AGt+(-AG );

p n' cat 2 p '

3- G «AG , AG* =AG*-(-AG )

p n cat 2 p

tосновное состояние реакции (AGp и отрицательные величины), что иллюст-

рует

AG

п

рируется рис.128.

Предсказание значений k

в теории Хей-на и Нимана возможно, если правильно выб-

cat

рать значение и о:

величины Кр и К^, используя значения микро-

еделить

скопических констант. Предполагается, что значительно выше константы

скорости соответствующе^ неферментативной реакции, хотя теория не объясняет причин этих различий.

Следует подчеркнуть, %то эта теория может быть использована лишь для ог раниченного числа субстратов. Она не учитывает роли вторичных взаимодействий, а значения микроскопических констант определяются тем набором субстратов, который в данном случае используется. При увеличении числа экспериментальных данных эти значения могут существенно измениться.

Кроме того, как и все модели непродуктивного связывания, модель Хейна и Нимана не объясняет различи^ в константе скорости второго порядка (к^+/Кт) для разных субстратов.

В соответствии с уравнением (7), для р=1

К

- кк,

2р р

(13)

т.е. константа скорости второго порядка не зависит от степени непродуктивного связывания.

Представления о непродуктивном связывании применимы и для объяснения различий в скоростях гидролиза промежуточных ацилферментов [1328,34051- Известно, что ацилхимотрипсины, образованные D-аминокислотами, очень медленно подвергаются гидролизу, причем чем более специфичной является аминокислота, тем медленнее идет ее расщепление. По-видимому, в D-ациламиноацилхимотрип-синах ацильный остаток расположен преимущественно неправильно, но лучшие объяснения этим данным дают представления о напряжении или индуцирова".-чом соответствии (см. ниже).

8.3.2. Теория напряжений

Из схемы I (см. разд.8.1) можно записать, что

•Л'

ES

ES Ф

4)

8.3. Теории и гипотезы. Дестабилизация основного состояния 363

где Квв и Кт

константы ассоциации фермента с субстратом и "переходным состоянием" соответственно, a и К* - константы равновесия образования активированных комплексов в катализируемой и некатализируемой, реакциях, причем в соответствии с теорией абсолютных скоростей реакций

k =

kT

К*,

(15)

отсюда

ЕВ

(16)

Это означает, что катализ возможен лишь в том случае (fe^,»fe^), если переход ное состояние эффективнее связано с ферментом, чем основное состояние реагирующей системы (т.е. К >>JL,„).

Эти соображения привели Холдена (1744, с.182), а затем Полинга (28431 к идее о том, что активный центр фермента структурно комплементарен не субстрату в его основном состоянии , а переходному состоянию реагирующих ве-

Рис.129. Энергетический профиль ферментативной реакции, демонстрирующий роль напряжения или деформации в основном состоянии

ществ. Таким образом, фермент, связывая субстрат, создает в нем напряжение или деформации (рис.129). Гипотетический фермент-субстратный комплекс, в котором отсутствуют напряжения (ES), имеет существенно более низкую свободную энергию, чем напряженный комплекс (ES*). Выигрыш в энергии активации соответствует энергии напряжения, т.е. энергия напряжения расходуется на дестабилизацию основного состояния, и вследствие этого активационный барьер понижается.

Теория напряжений претерпела определенную эволюцию от постулирования геометрических деформаций субстрата (теория "дыбы") (1375,24491 до трактовки напряжений как следствия десольватационных, электростатических и энтропийных эффектов (9,14041.

Важно подчеркнуть, что все эти эффекты в теории напряжений проявляются в основном состоянии. Дальнейшее развитие теории привело к убеждению, что они имеют большее значение для переходного состояния, чем для основного (см. разд.8.4).

364

Глава восьмая. Специфичность и эффективность. Теории и гипотезы

Аргументы в пользу реальности напряжений и деформаций в фермент-субстратных комплексах уже приводились в разд.8.2.5. Теория напряжений согласуется со. многими экспериментальными данными, хотя и сталкивается с определенными трудностями. Напряжение вызывает изменение в уровне свободной энергии основного состояния, т.е. в одинаковой степени увеличивает как ?т, так и fe .. Таким образом, величина к ./К , характеризующая специфичность фер-мента, не должна изменяться. Это видно из рис.129, где высота активационно-го барьера по отношению к исходному состоянию свободного фермента и свободного субстрата не зависит от напряжения в основном состоянии- фермент-субет-ратного комплекса. Это не согласуется с экспериментальными данными в отношении кинетики гидролиза, катализируемого многими протеазами. В большинстве случаев изменение длины пептидного субстрата не сказывается на величине К^, но изменяет fe и соответственно fe /К (см. разд.4.3.1.3).

8.3.3. Индуцированное соответствие

Если в теории напряжения энергия связывания субстрата с ферментом расходуется на деформацию субстрата, то в теории индуцированного соответствия эта энергия расходуется на изменение фермента (3019,3352,3406]. Предполагается, что хороший субстрат эффективно изменяет конформацию фермента в направлении энергетически невыгодной, но каталитически более активной структуры. Разные субстраты вызывают различный "конформационный ответ" фермента, чем и определяется их способность к превращению.

Кинетическую схему такого процесса можно записать в виде:

К \

Ер <*—» EpS-- продукты,

Ч К Г'

Е * Е S

п п

где Е - каталитически активная форма фермента; Еп - его неактивная форма; Кр=(Ер]/(Еп] и K*=(EpS]/(EnS]. Таким образом, между двумя формами фермента существует равновесие, сдвинутое в сторону неактивной формы (Еп), поскольку она является энергетически предпочтительной (?р«1), а субстрат изменяет это равновесие в пользу комплекса с активным ферментом так, что К*»?р. Скорость превращения субстрата описывается уравнением

--ЛЕ ](S ]

° °

V =--- (18)

К -^—r— +LS ]

3 К (ПК*) ° pv р

(учитывая условие Яр«1).

Отсюда следует, что наблюдаемая константа скорости второго порядка

!й ./К ) будет

oat и ^

8.4. Стабилизация переходного состояния

365

Рис.130. Влияние индуцированного соответствия на свободную енергию основного и переходного состояний ферментативной реакции

cat

(19)

а следовательно, и специ-не зависят от структуры

т.е. эта константа, фичность фермента субстрата, поскольку величина Кр характеризует равновесие между двумя формами свободного фермента.

Как видно из рис.130, чем выше разница в энергии двух состояний свободного фермента

Ь ./К .

cat m

Если же весь фермент на-

(чем меньше К ), тем выше К и тем меньше

р m

ходится в активной конформации, то выражение для Кт в знаменателе формулы (18) будет:

К =К

ПК'

(20)

а &са1/Кт=&г/Кз» Т-е- приобретает то же значение, что и в отсутствие индуцированного соответствия.

Хотя теория индуцированного соответствия в общем случае не решает проблем эффективности и специфичности катализа, были проанализированы случаи, когда специфичность может быть связана с индуцированными субстратом конфор-мационными изменениями (3407). Нет сомнения в том, что явление индуцирования субстратом конформационных изменений в ферменте существует. Эти изменения могут играть положительную роль в катализе, увеличивая ориентационные факторы, изменяя сольватацию или вызывая деформации субстрата. Заслугой теории является то, что она впервые привлекла внимание к важной роли конформационных изменений фер

страница 56
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Химия протеолиза" (8.49Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
купить гвоздики
Фирма Ренессанс лестница металлическая - доставка, монтаж.
собрать кресло престиж
вещи на храниение сзао

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(10.12.2016)