химический каталог




Химия протеолиза

Автор В.К.Антонов

>Химозин 1 ,16-10"2 0,25 46,4 4,2

Катепсин В 6.6.10"3 0,6 11 1

У этих ферментов вторичные взаимодействия субстрата, по-видимому, в разной степени "индуцируют" изменения, приводящие к продуктивному комплексу. Можно ожидать, что конформационные изменения, индуцируемые при связывании одного и того же субстрата (или субстратоподобного ингибитора), будут менее выражены у более специфических ферментов. Однако сравнительные исследования такого рода не проводились.

Амидгидролазы рассмотренных типов отличаются еще одной важной характеристикой: рН-оптимумом каталитической активности (см. разд.Б.2.3). Эти различия хорошо согласуются с различиями каталитического аппарата этих ферментов. Наличие у сериновых, цистеиновых и металлоэндопептидаз каталитически активного остатка гистидина, функционирующего как общее основание и общая кислота, ограничивает интервал рН состоянием ионизации имидазольной группы этого остатка. Характерно, что у цистеиновых ферментов, функционирующих при рН 5-6, значение рХа имидазольной группы в ацилферменте снижено до 4-4,5. В свободном ферменте рХа увеличивается до 8, что обеспечивает существование стабильной ионной пары ImR^.-.S" (см. разд.7.1).

Очевидно, что в кислой области рН эффективно функционировать в качестве нуклеофила могут только карбоксилат-ионы. Действительно, протеиназы, рабо-

7.11. К вопросу об эволюции химических механизмов

347

тающие в кислых средах, относятся к груше аспартатных протеиназ. Повышение рН, приводящее к ионизации обеих карбоксильных груш активного центра, лишает эти группы протондонорных свойств, необходимых для общего кислотного катализа.

Имеется по крайней мере один пример, когда сериновые протеазы функционируют в слабокислой среде: это сериновые карбоксипептидазы. В настоящее время очень мало известно о строении каталитического аппарата этих ферментов. Не исключено, что в качестве общей кислотно-основной группы у них функционирует карбоксильная груша, а не имидазольная, как у истинных сериновых амидгидролаз.

Отмечалась тенденция [24611 некоторых амидгидролаз выравнивать энергетические барьеры многостадийных реакций гидролиза, что, возможно, связано с компенсирующими изменениями конформации фермента по ходу катализа. Можно полагать, что это общее свойство ферментов рассматриваемой группы.

В отношении механизма действия амидгидролаз имеется больше нерешенных вопросов, чем установленных фактов. Данные, суммированные выше, относятся лишь к простейшим представителям каждой группы этих ферментов, но и здесь нельзя считать, что мы исчерпали возможности познания.

Табл.12 показывает, какое разнообразие амидгидролаз представляет природа. Экстраполяция наших знаний на все эти объекты вряд ли оправдана.

7.11. К вопросу об эволюции

химических механизмов амидгидролаз

Нет сомнения в том, что процесс протеолиза должен был происходить еще на самых ранних этапах химической эволюции. В этот период гидролиз пептидных связей мог катализироваться относительно простыми предшественниками протеолитических ферментов, вероятно, системами, использующими атомы тяжелых металлов. В настоящее время нам известны по крайней мере четыре типа весьма сходных механизмов гидролиза. Установить эволюционные отношения между ними весьма сложно. Во-первых, трудно установить иерархию механизмов, т.е. утверждать,- что один механизм совершеннее другого. По-видимому, отсутствует существенная разница в эффективности катализа разными протеазами, если использовать в каждом случае "идеальный" субстрат. Во-вторых, сейчас еще мало данных о типах протеолитических ферментов у разных видов организмов, отличающихся длительностью своей истории. Можно лишь высказать некоторые соображения по поводу эволюционных взаимоотношений амидгидролаз. Так, до сих пор не обнаружены аспартатные протеазы у прокариот. Этот тип ферментов широко распространен у низших грибов, млекопитающих, рыб и других животных, а также встречается у некоторых цветковых (насекомоядных) растений. Можно полагать, что аспартатные протеазы возникли на более поздних этапах эволюции, но не потому, что этот тип катализа более совершенен, а потому, что он приспособлен к определенным условиям, с которыми не сталкивались примитивные организмы.

Растения преимущественно содержат цистеиновые ферменты. Последние также широко распространены в тканях животных,-но встречаются у некоторых бактерий и Даже у вирусов.

Сериновые' протеазы встречаются как у прокариот, так и у эукариот. Проте-

348 Глава седьмая. Химическая трансформация субстрата

азы насекомых, хотя еще и недостаточно изучены, но преимущественно относятся к сериновому типу. Не менее широко распространены и металлзависимые протеазы. Здесь мы находим и ферменты микробов, и ферменты, функционирующие в тканях мозга. Из общих соображений заманчиво отнести именно этот тип протеаз к эволюционно древнейшему. Сходство структуры активных центров металлзависимых и сериновых протеаз, с одной стороны, и металлзависимых и аспартатных - с другой, наводит на мысль о том, что металлзависимые протеазы могут быть общим эволюционным предшественником этих двух типов ферментов.

Сейчас можно лишь надеяться, что дальнейшие исследования амидгидролаз разных типов живых организмов позволят составить более полное представление об эволюции химических механизмов протеолиза. Эта проблема будет затронута ниже (разд.8.7) в связи с представлениями об "идеальном" ферменте.

7.12. Заключение

Химическое превращение субстратов амидгидролаз осуществляется при участии каталитически активных групп фермента, функционирующих как нуклеофильные, общие основные и общие кислотные катализаторы. Характерной особенностью катализа, по-видимому, является действие нуклеофильной группы на резонансно дестабилизированную связь в продуктивном фермент-субстратном комплексе. Элементарный акт химического изменения субстрата должен в этом случае проходить со скоростями, близкими к скоростям диффузионно контролируемых процессов. Гидролитическая реакция - многостадийный процесс, проходящий обычно через образование тетраэдрических промежуточных соединений, скорость образования и распада которых определяется структурой субстрата и, главным образом, свойствами уходящей группы.

По типу катализа амидгидролазы могут быть разделены на две большие группы - ферменты, функционирующие по типу ковалентного катализа, когда каталитическая группа фермента образует ковалентное промежуточное соединение с субстратом, и ферменты, функционирующие по типу общего основного катализа, когда группа фермента способствует отщеплению протона от молекулы воды, выступающей как нуклеофильный реагент. Несмотря на эти различия, в механизмах действия всех изученных амидгидролаз можно усмотреть много общего. Возможно, что эволюция химических механизмов амидгидролаз восходит к одному общему предшественнику.

Глава восьмая

СПЕЦИФИЧНОСТЬ И ЭФФЕКТИВНОСТЬ. ТЕОРИИ И ГИПОТЕЗЫ

В настоящее время имеется множество теорий и гипотез, цель которых объяснить уникальные свойства ферментов - их специфичность и эффективность (см. обзоры: (9,1402,1613,2410,2450,2846,3345-3348]). Во многих случаях эти теории и гипотезы отличаются одна от другой лишь терминологией, так как основаны на одинаковой трактовке физической сущности рассматриваемых явлений.

Сравнивая каталитическое действие фермента на разные субстраты (специфичность) или сопоставляя его с модельной неферментативной реакцией (эффективность), оперируют каталитическими константами первого № t) или второго (ftoat/*Lm) порядка и константой скорости неферментативной реакции, которая может иметь псевдопервый или второй порядок. При сравнении с модельной системой обычно считают, что рассматриваемая модельная реакция протекает через те же промежуточные продукты, что и ферментативный процесс, т.е. является конгруэнтной.

Требования к модельной системе включают, помимо сходства структуры реагирующих групп, промежуточных соединений и идентичности продуктов реакции в сравниваемых системах, еще и близость значений рХа, участвующих в процессе группировок (3349]. Все эти требования не всегда удается соблюсти, и отношение констант скоростей ферментативной и модельной реакций может заметно изменяться а зависимости от выбора модели.

Значения эффективности, конечно, зависят от выбора субстрата ферментативной реакции. Так, часто приводимая [2424,2453,3350] величина ЫО5 (по ftcat/Km) для химотрипсина, основанная на использовании в качестве субстратов амидов N-ацетиламинокислот, на пять порядков отличается от величины, получающейся при использовании одного из лучших пептидных субстратов (см. разд.4.4).

8.1. Общие сведения

Рассмотрим диаграмму изменения свободной энергии ферментативной и неферментативной реакций (рис.121)1. Их основное различие заключается в том, что в ходе ферментативного катализа фермент и субстрат образуют комплекс, свободная энергия которого ниже, чем свободная энергия исходных реагентов. Если свободная энергия активации химической стадии остается одной и той же для обеих реакций, то увеличение скорости катализируемого процесса будет в точности пропорционально константе диссоциации фермент-субстратного комплекса. Это можно показать следующим образом. Рассмотрим два пути превращения субстрата - каталитический и некаталитический:

В качестве стандартного состояния здесь и далее используются изменения свободной енергии, отнесенные к 1 молю веществ при их концентрации 1М [3351].

350

Глава восьмая. Специфичность и эффективность. Теории и гипотезы

ДО,

E + S

¦S ES*

продукты

(1)

+ Е

В этом цикле равновесий справедливо равенство: <з - дСЕЗ = < ~ ДСТ'

(2)

Так как по условию свободные энергии активации двух процессов одинаковы (aG*s = aG*), то uGgg - uGr. Таким, образом, изменение уровня свободной энергии переходного состояния ферментативной реакции по отношению к состоянию исходных реагентов (дСг) будет энергии за счет комплексообразования.

нию исходных реагентов (дСг) будет в точности равно изменению свободной

Ли

Рис.121. Диаграммы изменений свободной" энергии 4С* по координате реакции (v) для неферментативного (1) и ферментативного (2") процессов

Для простейшей схемы ферментативного катализа:

Ks \

Е + S =——-» ES -> продукты

скорость равна:

ЕЛЕ! (S1

2 о с

u--

' К +CS]

Скорость соответствующей конгруэнтной модельной реакции будет: ft

S-> продукты

f+5 ES ES*(S*) Е+Р г

V — ft [S]

n nc

Отношение скоростей ферментативной и модельной реакции будет: v ft2CE)o

l> ft (К +fS] ) n n s о

или, учитывая, что AG|,g - AG* (т.е. ft2-ftn),

(El

К +CS-3'

8.2. Факторы катализа

351

В условиях, когда [S] «К , vjv -[Е] /К , а при [S] »К vjv -[Е] /[S] ,

J о a f п о а г с s / п о о

т.е. реакция не только не будет ускоряться, но и будет происходить медленнее, так как обычно Ш <(S] .

о о

Ясно, что образование фермент-субстратного комплекса само по себе без снижения энергии активации химического процесса не может обеспечить наблюдаемой эффективности ферментативного катализа.

Рис.122. Два способа понижения энергии активации: повышение энергии основного состояния (1) и понижение энергии переходного состояния (2)

Понижение свободной энергий активации ферментативной реакции по сравнению с конгруэнтной моделью можно, в принципе, реализовать двумя путями: или повысив свободную энергию основного состояния или понизив энергию переходного состояния (рис.122). В обоих случаях, используя выражение (2) и значения bG*g, &GES и д<3^ из теории абсолютных скоростей реакций, можно показать, что различия в свободных энергиях активации двух процессов (uGt) будет определяться выражением:

*/ \

b.G„ - - HTln—, где k.--.

т к f К

п 3

Все существующие теории ферментативного катализа ставят своей целью объяснение причин различий в к^ и кп, причем одни исходят из того, что это связано с изменением уровня свободной энергии основного состояния, а другие главную причину видят в понижении уровня свободной энергии (стабилизации) переходного состояния. Такая "классификация" существующих теорий и гипотез, конечно, в значительной степени условна, и четкую границу здесь не всегда можно провести, однако она удобна для изложения. Прежде чем перейти к изложению существующих концепций, необходимо познакомиться с факторами, которые могут вносить вклад в различие к и к .

8.2. Факторы катализа

Эффективность, т.е. отношение к ./К к , для амидгидролаз может достигать одиннадцати - двенадцати порядков (см. табл.50). Для некоторых других ферментов оценки эффективности дают значения 101б-1018 (3352, 3353]. Какие же факторы ферментативного катализа могут давать столь большие ускорения процесса?

8.2.1 Сближение и ориентация

В отличие от реакций в растворе реакции на ферменте происходят в ограниченном участке активного центра, где реагирующие группы сближены между собой.

352

Глава восьмая. Специфичность и эффективность. Теории и гипотезы

Это приводит к увеличению локальной концентрации реагирующих групп, что эквивалентно уменьшению tG* (1).

Разные исследователи давали различную оценку вклада этого фактора. Так, исходя из тех соображений, что для молекул, соответствующих по размеру молекулам воды, максимальная концентрация составляет 55 М. Кошланд [16151 принимал эту величину как максимальную "эффективную концентрацию" при ферментативных реакциях. Такой концентрационный эффект соответствует изменению свободной энергии, равному 2,4 ккал/моль, или изменению энтропии на 8 э.е. При этом, естественно, не учитывается ориентационный эффект, который может достигать значительно больших величин. Так, исследования реакции диеновой конденсации [1616,16171 дают значения суммарной потери энтропии порядка -45 э.е. Эта величина складывается из значений, приведенных в табл.80.

Таблица 80. Изменения ентропии для различных типов движения

Тип движения AS, е .е.

Поступательное движение (3 степени свободы) 29- 36

Вращательное движение (3 степени свободы)* 5- 6

Внутреннее вращение (см-1) 1000 з- 5

Колебания с частотой 0, 1

400 1, 0

100 3, 4

*На одну связь.

О роли ориентации в катализе свидетельствуют также данные по внутримолекулярным реакциям (см. гл.З), когда наблюдаемые ускорения по сравнению с соответствующими межмолекулярными процессами достигают 10б-107.

Сходные величины эффектов сближения и ориентации получены (33541 теоретически на основе статистической термодинамики. Отношения констант скоростей внутри- №т) и межмолекулярной (fefc) реакций даются уравнением:

1

k/k.--, (3)

m ь NeV

где N - число Авогадро, a aV- элемент объема, в пределах которого находится центр масс реагирующих групп. Значения sV могут соответствовать сфере с ди-

о

аметром, равным амплитуде колебаний образующей связи, т.е. «0,05 А, что даст отношение k /ft.-3-Ю7 М.

m о

Эффекты сближения и ориентации особенно значительны при высоких порядках реакций. Так, если два субстрата превращаются в продукт под действием трех катализаторов, то в растворе эта реакция и

страница 54
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Химия протеолиза" (8.49Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
Компания Ренессанс: лестница винтовая из дерева - оперативно, надежно и доступно!
ручка venezia collezione monte cristo серебро
Dell XPS 15 9550-2334
наматрасники медицинские водонепроницаемые купить

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(25.09.2017)