химический каталог




Химия протеолиза

Автор В.К.Антонов

х) субстратов второй комплекс является, скорее всего, комплексом фермента с продуктами гидролиза, т.е. лимитирующей скорость стадией процесса в этом случае является диссоциация продуктов [3242]. По-видимому, в случае металлзависимых амидгидролаз образовавшаяся при гидролизе карбоксильная группа субстрата остается в координационной сфере металла и лишь затем вытесняется молекулой воды. Механизм такого отщепления в случае термолизина показан на рис.115 [3316].

Отсутствие ковалентных промежуточных соединений в указанных выше случаях ставит вопрос о механизме ацильного переноса и транспептидации. Сам факт катализа амидгидролазами таких реакций долгое время служил основным аргументом в пользу образования промежуточных ковалентных ацилферментов, а у аспартатных протеаз - и "аминоферментов" (1749,1750,2173,2177,2178,3342, 3343]. Реакции транспептидации были объектом детального изучения (см. разд. 4.8.1 ).

Если реакции переноса идут из нековалентных комплексов фермент-продукт, то стабильность этих комплексов должна быть достаточно высокая, чтобы обеспечить связывание акцептора транспептидации и образование химической связи между переносимым фрагментом и акцептором. Располагая данными о начальных скоростях транспептидации [1667] и константах диссоциации комплексов фермент-продукт, можно оценить выполнимость этого условия.

Кинетическую схему транспептидации можно представить в виде:

7.9. Ацилферменты и комплексы фермент-продукт

339

К \ к3 Е + S--» ES-> ЕР,--- Е + Р,,

ЕР, + А -» ЕР„А -* Е 4 S*,

1 г? 1

r-a

где S - субстрат; S* - продукт транспептидации; Р1 и Р? - соответственно первый (переносимый) и второй продукты гидролиза; А - акцептор транспептидации.

Отношение скоростей гидролиза и транспептидации дается уравнением vh кзк-л 1

V. Й.Й,- (А)

t 4 о с

Если допустить , что &3<«й_4, то можно вычислить константу скорости распада комплекса фермент-продукт (ЕР ¦):

к3 = /— WA]o-

Полученные результаты для некоторых реакций транспептидации представлены в табл.78. В расчетах принималось значение й4=:1 •Ю7 М-1 с-1,, а остальные данные были взяты из работы (16671-

Таблица 78. Константы скорости распада комплекса пепсин-продукт. Акцептор - Phe(N02)0H; [A]o=0,667 мМ; рН 4,6; 37°С

Субстрат* Vh/Vt й5, с"1 *3, с"1

АсРпеТугОН АсТугТугОН AcPhePheApm GlyGlyPhePbeApm *Apm - 3- (морфолино! 22,0 22,2 351 380 тропил )-ам1 5,1 -10~4 4,9-Ю"4 7,75-Ю"4 8,1 .10~4 1Д. 8,65 8,5 42,5 45,3

Данные табл.78 показывают, что константы скорости распада комплекса фермент-продукт, необходимые для обеспечения наблюдаемых скоростей транспептидации, лежат в области 10-50 с-1.

Экспериментально определяемые константы скорости диссоциации комплексов фермент-продукт (или фермент-ингибитор) составляют 1-104-1-Ю5 с-1, что на три-четыре "порядка выше необходимых для транспептидации. Таким образом, обычный комплекс фермент-продукт не может быть тем комплексом, который участвует в реакции переноса фрагмента субстрата на акцептор.

Это противоречие можно разрешить, если предположить, что на пути превращения субстрата в продукт возможно не только ступенчатое образование про-

340 Глава седьмая. Химическая трансформация субстрата

дуктивного фермент-субстратного комплекса (см. разд.6.2.3), но и ступенчатая диссоциация комплексов фермента с продуктом:

К КР К KR KQ Kt

Е + S —- EQS »—- EpS-> Vi^ '—* EPPi '—* »—- E + P1.

+

В этом случае кажущаяся константа диссоциации комплекса ЕрР1 будет:

к; =-, где к =

t 1 I v V

1+KQ' « ну,]"

Если XQ»1, то наблюдаемая константа ингибирования продуктом K*=Kt, т.е. характеризует лишь образование комплекса Е0РП. Превращение EqP1 в ЕрР1 лимитируется в этом случае низкой константой скорости (ft ) в реакции:

ft

ЕРР1 -~*ЕоР1-

-q

Если превращение ЕрР1 в EQP1 идет с константой скорости (ftq=ft3) порядка 10-50 с-1, то при XQ>1 ft_q должна быть меньше указанных величин.

Таким образом, можно предположить, что транспептидация происходит в комплексе ЕрР,, способном связывать акцептор. Образование этого комплекса легко идет из субстрата в ходе его гидролиза. Если же в системе субстрата нет, то образование комплекса EpPj ограничивается низкой скоростью превращения EQP1 в ЕрР1. В этом случае продукт и акцептор могут реагировать, образуя новый пептид в количестве, определяемом константой равновесия всего процесса.

Очевидно, что комплекс ЕрРпР2 может распадаться, элиминируя не только Р , но и Р2. В зависимости от относительного сродства обоих продуктов в этом комплексе может происходить реакция ацилыюго переноса или аминопереноса. Так, в случае пепсина и субстратов со свободной карбоксильной группой рядом с гидролизуемой связью происходит преимущественно аминоперенос, а у субстратов со свободной аминогруппой наблюдается, в основном, ашльный перенос (2176-2178].

Собственно акт образования новой пептидной связи должен в соответствии с принципом микроскопической обратимости происходить по механизму, в точности обратному механизму гидролиза.

Стадийность распада комплексов пепсина с продуктами подтверждается сравнением стационарных и предстационарных скоростей гидролиза флуоресцентных пептидных субстратов этого фермента [2976].

7.10. Механизмы ферментативного гидролиза в сравнительном аспекте

Механизмы ферментативного гидролиза принципиально не отличаются от механизмов гидролиза в модельных системах. Ни в том, ни в другом случае мы, к сожалению, не можем утверждать, что механизм реакции нам в точности известен, т.е. известно положение в пространстве и распределение электронной плотное-

7.10. Сравнительные аспекты ферментативных механизмов

341

ти для каждого атома реагирующей системы в каждый момент времени реакции. Ферментативные системы имеют в этом отношении даже некоторые преимущества перед реакциями в растворе, поскольку, используя различные аналоги субстрата, можно в принципе получать рентгеноструктурные "снимки" отдельных стадий процесса.

На рис. 116-119 даны схемы ферментативного гидролиза, которые, по мнению автора, в наибольшей степени соответствуют всей сумме имеющихся данных.

Важнейшей стадией ферментативного гидролиза является образование фермент-субстратного комплекса. Этот процесс проходит в несколько (по крайней мере, в две) стадий. На первой стадии реализуются в основном неспецифические и дальнодействующие взаимодействия (гидрофобные, электростатические), а на второй - происходит более тонкая "подстройка" субстрата и активного центра фермента, включающая образование новых связей и конформационные изменения как субстрата, так и фермента. Результатом этого процесса является образование продуктивного фермент-субстратного комплекса.

Общим для большинства исследованных амидгидролаз является наличие определенной локализованной области связывания одной боковой цепи пептидного субстрата, обычно принадлежащей аминокислотному остатку, расположенному рядом с гидролизуемой связью. Это так называемые гидрофобные карманы, наиболее четко выраженные у ферментов химотрипсиновой группы, но имеющиеся также у ферментов со "щелевым" типом связывающего участка. В этом "кармане" могут

Рис.116. Схема механизма катализа а-химотрипсином

342

Глава седьмая. Химическая трансформация субстрата

Рис.117. Схема механизма катализа папаином

располагаться заряженные группировки (трипсиноподобные ферменты) или ал-кильные цепи (эластаза и др.), ограничивающие его размеры.

У всех протеаз в большей или в меньшей степени развиты участки вторичной специфичности, связывание субстрата с которыми происходит путем образования водородных связей. Связывание пептидных субстратов происходит без существенного изменения конформации их основной цепи. Это, вероятно, имеет важное значение в реакциях гидролиза связей в нативных белках (ограниченный проте-олиз, активация зимогенов и т.д.).

Наконец, есть все основания полагать, что связывание в активном центре фермента приводит к искажению пленарной структуры расщепляемой связи субстрата за счет вращения вокруг связи C-N и за счет пирамидализации. Это искажение должно быть значительным у сериновых и аспартатных протеаз, имеющих слабые атакующие нуклеофильные группы и, может быть, менее выраженным у металлсодержащих ферментов из-за наличия сильного электрофила (Zn2+), поляризующего расщепляемую связь.

По типу катализа амидгидролазы могут быть разделены на две большие группы - функционирующие по типу ковалентного катализа, куда входят сериновые и

7.10. Сравнительные аспекты ферментативных механизмов

343

(Asp 32)

(Asp 215}

НО—С—R /ОН ое

гранспептидация

Рис.118. Схема механизма пепсинового катализа

н.... О.

His 196ч \ Glu 72-Х О &СЫ» 270

L—v. wu— -^ 7п Н -0\

Hls 69Г 0=C-NHR2 О .О /

R с.

н

^ \ 2 R NHR

G?C- ,Zn. Н-О^

6 "он 0 ~*- О .0 tyc~

I, NH2R2 /l \+ 2

R 2 R NH?R

Рис.119. Схема механизма катализа карбоксипептидазой А

цистеиновые амидгидролазы, и функционирующие по типу общего катализа - аспартатные и металлзависимые ферменты.

Несмотря на это различие в механизме катализа и строении каталитического аппарата всех до сих пор изученных амидгидролаз имеется много общего. В общем виде схема механизма гидролиза амидов и типы каталитических групп, свойственных представителям различных амидгидролаз, могут быть представлены следующим образом:

344 Глава седьмая. Химическая трансформация субстрата

R R R

-О Н-А-»¦ ВН Х-С-0 ...Н-А-> В: Х-С-0

NH NH NH+

I I 2

R

У. Х-А-0

.Н-А-

-»- В: Х-С-0 Н-А—»- Повторение цикла (сериновые, цистеиновые).

В R X АН

Сериновые ^:(His57) -CH2(Ser195) О NH(Gly193, Ser195)

Цистеиновые )N:(His159) -CH2(Cys25) S HH(Gln19, Cys25)

0

Аспартатные -C-0-(Asp32 и H 0 H (?)

Asp215)

0

„24

Металлзависимые -C-0 (Glu270) H 0 Zn

Сходство между этими механизмами достаточно очевидно.

Попытаемся проанализировать важнейшие каталитические свойства амидгидролаз с точки зрения изложенных выше механизмов катализа. Наличие системы расположенных рядом нуклеофильных и электрофильных группировок обеспечивает возможность расщепления электронно-лабильных связей производных карбоновых кислот. Реакция гидролиза амидной связи - это ступенчатое понижение энергии C-N связи за счет поляризации:

о о о~ о~ о

_XX х А 1.37 1.39 1.43 1-50

ОО

fC-N

AEC_N 86 -70 66 46

ккал/моль

Для осуществления такого процесса в физиологических условиях достаточно того набора нуклеофильных и электрофильных групп, который имеется в белках, в том числе амидгидролазах. Очевидно, что эти группы недостаточно активны для того, чтобы присоединяться к насыщенному атому углерода. Катализ реакций переноса насыщенных групп осуществляется в ферментах при посредстве кофакторов, таких, как, например, S-аденозилметионин (см. в: (1405)).

Вместе с тем в ряду производных карбоновых кислот специфичность (в терминах &cat/Km) ферментов разных типов по отношению к разным связям варьирует (см. разд.4.3.1.1).

Было показано (2009,3344), что различия в скоростях гидролиза эфиров и амидов у сериновых протеаз, достигающие четырех порядков, обусловлены исключительно различиями в стандартной свободной энергии их гидролиза, т.е.

7.10. Сравнительные аспекты ферментативных механизмов

345

объясняются различным состоянием расщепляемой связи в субстрате (рис.120). Энергетический уровень переходного состояния для эфиров и амидов практически одинаков. Это является демонстрацией справедливости в данном случае постулата Хэммонда (1531) о сходстве структуры основного и переходного состояний в экзоэргических реакциях и указывают на определяющую роль основного состояния фермент-субстратного комплекса в реакциях, катализируемых серино-выми протеазами.

У аспартатных и металлзависимых протеаз соотношение скоростей гидролиза эфир-амид близко к единице. Это трактовалось (3342) как свидетельство превалирующей роли электрофильного катализа (т.е. протонирования карбонильного углерода и координации с металлом) у этих типов ферментов. Следует отметить, что и у цистеиновых протеаз соотношение 1,ефИр/1,амИдк,Б. Вклад электрофильного катализа в этом случае невелик. Возможно, что, по крайней мере в случаях аспартатных и цистеиновых протеаз, отсутствие заметных различий в скоростях гидролиза эфиров и амидов объясняется, если не полностью, то частично, меньшей разницей в свободных энергиях гидролиза этих субстратов при более кислых значениях рН (см. рис.28). Следует отметить, что существуют амидгидролазы, функционирующие в нейтральной среде и совсем не имеющие эстеразной активности. Различие в поведении эфирных и амидных субстратов карбоксипептидазы А может быть обусловлено различиями в характере определяющей скорость стадии многостадийного процесса гидролиза (3139).

Как показано на рис.120, переход от AcPheGlyNH"2 к AcPheAlaNH2, т.е. введение одной метальной группы, приводит к значительному снижению уровня энергии переходного состояния практически без- изменения уровня энергии основного состояния. Иными словами, специфичность в этом случае проявляется в максимальной скорости гидролиза, а не в связывании. Такая ситуация харак-

Рис.120. Изменение свободной энергии по координате реакции (г) при ацилировании химотрипсина субстратами типа AcPhe(N02)-X [3344]

X: 1- OEt; 2- ОМе;

3- NHC,H,MO,-n; 6 4 2

ггас6н5;

NHNH2; AlaNH„

5- NH

2"

GlyNH_

го

гг

1-7

346 Глава седьмая. Химическая трансформация субстрата

терна для многих протеаз: особенно четко она проявляется для пепсина (см. разд.4.3.1.3.). Вторичные взаимодействия, по-видимому, играют решающую роль в образовании продуктивного комплекса, причем энергия этих взаимодействий используется для компенсации энергетически неблагоприятных изменений системы (конформационные изменения, дестабилизация расщепляемой группы и т.д.). Такая трактовка позволяет приблизиться к пониманию причин уникальной специфичности некоторых амидгидролаз. Среди представителей каждой группы ферментов имеются амидгидролазы с широкой специфичностью и такие, которые катализируют гидролиз одного или очень ограниченного числа однотипных субстратов. В качестве примера можно привести почечный ренин, действующий на ангиотен-зиноген и слабо гидролизующий некоторые аналоги N-концевого фрагмента этого субстрата. Не удалось обнаружить каких-либо других пептидов, эффективно гидролизуемых этим ферментом.

Даже в ряду менее специфичных амидгидролаз наблюдаются очень большие различия в скорости расщепления пептидов в зависимости от числа аминокислотных остатков в них (табл. 79). Обращает на себя внимание тот факт, что различия в активности обусловлены изменением ftcat, а не Хт, т.е. разные ферменты обладают практически одинаковым сродством к данному субстрату, но превращают его со скоростями, отличающимися на 4 порядка.

Таблица 79. Гидролиз пептида ZbeuValPhe(NO )AlaApm аспартатными протеазами [1715]

Фермент ft +, о"1 cat R -103, М m ft +/к , cat m М-1с"1 Относительная ' активность

Пепсин 43 0,3 1,43-Ю"5 1 ,3-104

страница 53
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Химия протеолиза" (8.49Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
fhtylf yjen,erjd
Рекомендуем компанию Ренесанс - деревянные лестницы в леруа мерлен фото и цены - надежно и доступно!
стул кресло престиж
Выгодное предложение в КНС Нева на УПС - кредит онлайн не выходя из дома в Санкт-Петербурге!

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(11.12.2016)