химический каталог




Химия протеолиза

Автор В.К.Антонов

еноса протона от гидроксильной группы тетраедрического промежуточного соединения [3131]

332

Глава седьмая. Химическая трансформация субстрата

затора на стадии протонирования уходящей группы.

Очевидно, именно эта группа служит донором протона на уходящую группу [1715]. Это может происходить путем согласованного общего основного - общего кислотного катализа переноса протона от гидроксила тетраэдрического промежуточного соединения на Asp32 и переноса протона от Asp215 на уходящую группу [1715,33151 (см. разд. 7.10). Другой механизм [3131 ] заключается в переносе протона с одной гидроксильной группы тетраэдра на уходящую группу с участием протонов из среды (рис.112). Следует отметить, что согласно квантово-химическому изучению модели [3265], перенос протона от Asp215 на уходящую группу должен сопровождаться поворотом карбоксильной группы на «180°. Не исключено, что это достигается подвижкой доменов относительно друг друга в ходе катализа (см. разд.6.5.3).

Распад тетраэдрических промежуточных соединений у металлосодержащих амидгидролаз - карбоксипептидазы А, термолизина и дипептидилкарбоксипепти-дазы скорее всего катализируется карбоксильной группой (Glu270 и Glu143 у карбоксипептидазы А и термолизина соответственно) (3136,3137,3316,3317]-Предположения об участии в этом процессе остатка Туг248 карбоксипептидазы А [149], как отмечалось выше, не подтвердились. Карбоксильная группа функционирует как общее основание, способствуя ионизации связанной с Zn2+ воды, и как общая кислота, перенося протоны на уходящую группу. У термолизина один

о

из кислородов G1U143 расположен на расстоянии 3,2. А от атома азота уходящей группы (3316). Участие обоих атомов кислорода тетраэдра в координации с ионом Zn2+ объясняет неспособность метанола заменять воду в катализируемых металлсодержащими протеазами реакциях (3139):

о

9 r'nhcr о r'hncr

<

Glu 143-

0"-Ну /Н

о '-. К**/ His 231

| His 231

Zn)

©

Glu 143—С

V

r'nilcr

/\

His 231

7.9. Ацилфермента и комплексы фермент-продукт

Распад тетраэдрических промежуточных соединений или реакции типа в случае сериновых и цистеиновых амидгидролаз приводят к образованию ацилфермен-тов:

0 0 Б-ХН + R-C-YR' -> E-X-CR + HYR'.

7.9. Ацилферменты и комплексы фермент-продукт

333

Доказательства того, что ацилферменты являются промежуточными соединениями на пути от субстрата к продукту, были приведены выше (см. разд.7.4) В условиях насыщения фермента субстратом стационарная концентрация ацилфермента при гидролизе специфических эфирных субстратов практически равна концентрации фермента.

При гидролизе амидных субстратов ацилфермент не накапливается в системе. Стационарная концентрация П-ацетил-1-фенилаланилхимотрипсина, образующегося при гидролизе П-ацетил-1-фенилаланилглицинамида, при рН 5,5 составляет 0,15% (1730].

Одно время считалось, что ацилферменты - богатые энергией промежуточные соединения. Имеющиеся в настоящее время данные [1412,1730,3290,3318] показывают, что это не так. Например, изменение стандартной свободной энергии гидролиза К-ацетил-1-фенилаланилхимотрипсина при рН 7,3 составляет -3,4 ккал/моль, а при рН 5,5 близко к нулю, тогда как изменение свободной энергии гидролиза метилового эфира ацетилфенилаланина при нейтральных значениях рН около -6,0 ккал/моль [1415]. Аналогичные данные были получены для неспецифических ацилхимотрипсинов. Так, фуроилхимотрипсин примерно на 3 ккал на моль устойчивее О-фуроил-П-ацетилсеринамида [3290], а гиппурилпапаин примерно на 8 ккал/моль устойчивее соответствующих тиоловых эфиров (3318].

Образование ацилфермента - экзотермическая реакция: для ацетилхимотрип-сина &Но=-7 ккал/моль (3319] при рН 8,0. Предполагалось, что ацилирование химотрипсина нитрофениловым эфиром уксусной кислоты идет сначала с образованием ацетилированного по имидазолу His57 производного, которое изомеризу-ется в 0-ацетил-(Бег195)-химотрипсин [3320]. Были получены данные, что де-ацилирование ацетилхимотрипсина также идет в две стадии, однако в дальнейшем они были опровергнуты [3321].

Как уже отмечалось (см. разд.4.3.2.2), наблюдается компенсация энтальпии' и энтропии активации процесса деацилирования ацилферментов с Тс= 420°К [3322], что объясняется, по-видимому, сольватацией переходного состояния в этой реакции.

Хотя изменение свободной энергии при гидролизе тиоэфиров несколько (на 2-3 ккал/моль) выше, чем кислородных эфиров, скорости их щелочного гидролиза различаются очень мало. Деацилирование неспецифических ацилпапаинов происходит несколько быстрее, чем соответствующих ацилхимотрипсинов, но специфические ацилхимотрипсины гидролизуются заметно быстрее ацилпапаинов [3323].

Деацилирование ацилферментов ставит те же проблемы, что и ацилирование, но в более острой форме. Поскольку нуклеофильным агентом в этих случаях является молекула воды, движущей силой эффективного деацилирования может быть или эффективный общий основной катализ, или же дестабилизация эфирной группы в ацилферменте.

Уже на ранних этапах исследования ацилхимотрипсинов были обнаружены [1985) спектральные аномалии хромогенных неспецифических ацилхимотрипсинов, которые могли свидетельствовать о дисторсии сложноэфирной группы. Это подтвердилось рентгеноструктурными данными (1328) 6-(3-индолил)-акрилоилхимо-трипсина (см. также рис.113):

334

Глава седьмая. Химическая трансформация субстрата

СН-СН-С-О-Е.

Анализ этих данных показывает, что сложноэфирная группа заметно искаже-

о

на: она пирамидализована (дс=0,3 А), а двугранный угол ш составляет всего лишь -122°.

РИС.113. Стереомодель р-(3-индолил)-акрилоил-а-химотрипсина [1328]

Исследование резонансных Раман-спектров ряда ацилферментов [3100,3101] показало, что частоты сложноэфирной группы близки частотам альдегидного карбонила. Сходные выводы были получены [3324] при изучении ЯМР-спектров селенсодержащих ацилхимотрипсинов. Наблюдается корреляция между степенью поляризации карбонильной группы в ацилхимотрипсинах и скоростью их деацилирования [3325].

Рис.114. Зависимость заряда на карбонильном углероде в метилацетате и порядка связи между этим углеродным атомом и О-атомом атакующей молекулы воды от степени пирамидализации слож-новфирной группы (рассчитано С.Л.Александровым методом СШЮ/2)

Таким образом, по крайней мере у исследованных ацилферментов, а вероятно, и у других эфирная связь резонансно дестабилизирована. Пирамидализация сложноэфирной группы приводит к изменению заряда на карбонильном С-атоме и порядка связи, образующейся между атомом кислорода воды и карбонильным углеродом (рис.114). Величина дс=0,3 близка к величине пирамидальности пол-

7.9. Ацилферменты и комплексы фермент-продукт

335

ностью тетраэдрического углеродного атома. Возможно, что такая большая величина не реализуется в ходе гидролиза специфических субстратов химотрипсина, тем не менее дестабилизация сложноэфирной связи в ацилферменте может быть одной из причин высоких скоростей деацилирования (ср. (3326]).

Сложноэфирная группировка в индолилакрилоилхимотрипсине находится в несколько искаженной Z-конформации (см. рис.113). Это не согласуется с предположением (1985,3327) о Е-конформации этой связи в производных замещенных акрилоилхимотрипсинов, сделанным на основе спектральных изменений, происходящих при ацилировании фермента.

Расстояния между Ые2-атомом остатка His57 и карбонильным С-атомом ацилфермента составляют по результатам рентгеноструктурных исследований (1221,

о

1328,3328) и данным конформационного анализа (3024) от 4,1 до 4,8 А. Молекула воды в кристалле индолилакрилоилхимотрипсина расположена так, что она образует две водородные связи: 1) с Ne2—атомом His57 и 2) с карбонильным кислородом сложноэфирной связи. Такое положение молекулы воды не является продуктивным, и в ацилферментах, подвергающихся быстрому гидролизу, вода должна занимать другое положение, которое, по-видимому, близко к положению уходящей группы в фермент-субстратном комплексе. Если это так; то расстояние между Ne2-aTOMoM His57 и атомом кислорода воды должно составлять 2,8-

о

3,0 А. Это расстояние отвечает наличию хорошей водородной связи и удовлетворяет условию эффективности общего основного катализа присоединения воды к карбонильной группе ацилфермента.

С общим основным катализом деацилирования согласуются стерические эффекты ацильной группы (1967). Следует подчеркнуть, что реакционная способность молекулы воды, участвующей в деацилировании ацилферментов, содержащих специфическую ацильную группировку, близка к реакционной способности гидрок-сил-иона. Этот вывод был сделан (3329) на основе анализа скоростей деацилирования и щелочного гидролиза субстратов. Однако вопрос о том, обусловлена ли эта высокая реакционная способность особенностями структуры воды в активном центре ацилфермента или особенностями структуры расщепляемой связи, нуждается в дополнительном изучении.

Нуклеофильная атака молекулой воды эфирной связи в ацилферменте приводит

к тетраэдрическому промежуточному соединению. Реакция типа здесь мало

вероятна в силу низкого значения рй уходящей группы - серинового гидрокси-

+ а ла (рйа R-0H-R »-1). Образование тетраэдрического промежуточного соединения

подтверждается зависимостью скорости деацилирования от рйа замещенных ацилхимотрипсинов (заместитель в ацильной группе) (33301.

Протонирование серинового гидроксила при распаде образовавшегося тетраэдрического промежуточного соединения может происходить в "постпереходном" состоянии, т.е. сериновый гидроксил, будучи лучшей уходящей группой, чем гидроксильная группа присоединившейся молекулы воды (рКа соответственно 13,5 и 15,5), может уходить в виде аниона и протонироваться имидазолий-катионом His57.

Исследование кинетического изотопного эффекта растворителя в смесях с разным соотношением Н20 и D20 (2439,3177,3178,33311 дало основание утверждать, что при деацилировании неспецифических ацилхимотрипсинов происходит перенос одного протона (^/^«2,5), но де ацилирование высокоспецифичных

336 Глава седьмая. Химическая трансформация субстрата

ацилферментов сопровождается переносом двух протонов. В случае хороших субстратов это было приписано функционированию системы переноса заряда (перенос второго протона между His57 и Asp102); однако более вероятным представляется -участие в деацилировании одного из протонов, образующих Н-связь в оксианионной полости (см. также: (2438]).

Ацилирование сериновых протеаз специфическими субстратами повышает "жесткость" белковой молекулы и снижает ее чувствительность к рН-зависимым конформационным переходам (3332]. основную роль здесь играют боковые цепи остатка Р субстрата. Вместе с тем взаимодействие этих боковых цепей с участком их связывания в активном центре (St) приводит к конформационному изменению фермента, способствующему дальнейшему протеканию реакции. Это, в частности, было показано (3333,3334] на серии так называемых обратных субстратов трипсина типа

Расщепление этих субстратов приводит к образованию ацилферментов с неспецифической группой COR, где R=CH3, С2Н5, С3Н7 и др. Добавление к ацил-ферменту аминов заметно увеличивает скорость их деацилирования, причем использование флуоресцентно меченных групп R показало, что конформационное изменение увеличивает доступность ацильной группы воде.

В случае цистеиновых протеаз деацилирование ацилферментов происходит в целом по такому же механизму, как и деацилирование сериновых протеаз. Здесь возможны два основных отличия. Во-первых, рКа остатка His159 в папаине («4,2) заметно ниже, чем рКа His57 в химотрипсине («7), поэтому можно ожидать, что скорость переноса протона от воды на имидазол должна быть почти на три порядка ниже у цистеиновых ферментов по сравнению с сериновыми. Возможно, что это компенсируется большей степенью дестабилизации эфирной группы в тиоэфирах, однако, как это следует из данных резонансных Раман-спект-ров дитиоацилпапаинов (3102,33351, связь C-S скорее укорочена за счет взаимодействия атома серы фермента с атомом азота Р -остатка. Во-вторых, распад тетраэдрического промежуточного соединения в случае цистеиновых ферментов не требует протонирования уходящей группы. Уход группы -CHgS" сразу регенерирует активную форму фермента.

Ацилферменты цистеиновых протеаз существуют в двух конформациях - А и В, причем конформация В доминирует (33361:

В А

Две формы, по-видимому, существуют и у ацилхимотрипсинов (33371- Динамика ацилферментов сериновых протеаз исследована в работах (3338-33401.

Образующийся в результате деацилирования комплекс фермент-продукт должен диссоциировать с образованием ацильного продукта и регенерацией свободного

7.9. Ацилферменты и комплексы фермент-продукт

337

фермента. Хотя сродство продуктов гидролиза к ферменту обычно близко к сродству субстратов, это не сказывается на скорости гидролиза вплоть до значительных степеней превращения субстрата, так как концентрация свободно-

TrP US

His 231

Рис.115. Механизм катализа термолизином [3316], включающий комплексы ЕР^Р^ и ЕР^, в которых образовавшаяся карбоксильная группа продукта остается включенной в координационную сферу металла

ES и ЕТ - соответственно комплекс Михаэлиса и тетраэдрическое промежуточное соединение

22. ВК. Антонов

338 Глава седьмая. Химическая трансформация субстрата

го продукта остается низкой, однако при высоких концентрациях продуктов скорость будет падать за счет конкурентного торможения продуктом. Не исключено, что, как и ассоциация фермента и субстрата (см. разд.6.2.3), диссоциация комплексов фермент-продукт происходит ступенчато. Этот вопрос будет подробнее рассмотрен ниже. Кроме того, учитывая низкую свободную энергию гидролиза ацилфермента при кислых значениях рН, следует иметь в виду, что в этих условиях деацилирование будет происходить весьма медленно, накопление продукта может приводить к обращению реакции и образованию ацилфермента L2003,334D. Действительно, рентгеноструктурный анализ комплексов протеазы А из Streptomyces grlseus с продуктом показал (3063,3129]. что карбоксильная группа продукта образует Н-связь с имидазолий-катионом His57. Эта связь стабилизирует комплекс и ее разрушение (при нейтральных рН) способствует диссоциации продукта.

Как было показано выше (см. разд. 7.4), пепсин, лейцинаминопептидаза, термолизин и карбоксипептидаза А (амидные субстраты) функционируют по типу общего основного катализа на стадии нуклеофильной атаки карбонильной группы гидролизуемых соединений. При этом, очевидно, исключается образование ацилферментов. Что касается гидролиза сложноэфирных субстратов карбоксипептида-зой, то в условиях криоэнзимологического эксперимента были получены данные, которые трактовались как свидетельство промежуточного образования ацилфермента - ангидрида, образованного карбоксильными группами фермента и субстрата. Эти данные нуждаются, однако, в подтверждении (см. разд.7.4).

Как указывалось выше (см. разд.6.2.3), при катализе гидролиза пептидных субстратов карбоксипептидазой А четко прослеживается образование по-крайней мере двух комплексов фермента с субстратом. В случае же эфирных (депсипеп-тидны

страница 52
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Химия протеолиза" (8.49Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
проектор и экран в аренду москва
Компания Ренессанс: лестница- просто.ру - всегда надежно, оперативно и качественно!
кресло престиж размеры
Магазин KNSneva.ru предлагает 90NB09P1-M03170 - офис продаж со стоянкой: Санкт Петербург, ул. Рузовская, д.11, тел. (812) 490-61-55.

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(10.12.2016)