химический каталог




Химия протеолиза

Автор В.К.Антонов

ийся в ходе гидролиза аминный продукт:

Е + RCONHR' + Н*0-> E-RC0*0H + R'NH,

E-RCO*OH + NH2R'-> E-RC*ONHR'.

Это было доказано сравнением степени включения 180- и 15N- (или 14С-) меченных продуктов в исходный субстрат [2040, 32771- Таким образом, исследования кислородного обмена в субстрате ни при отрицательных, ни при положительных результатах не являются свидетельством за или против образования тетраэдрического промежуточного соединения.

Механизм типа S^, включающий перенос протона на уходящую группу в пред-переходном состоянии, был предложен для химотрипсина еще в 1967 г. (3278-

7.7. Промежуточное тетраэдрическое соединение

325

3280]. Этот механизм предусматривает участие имидазола остатка гистидина в переносе протона с серинового гидроксила на азот амидной группы. Скорость реакции в этом случае должна зависеть от рй уходящей группы:

Л 0~ R

I

с=о

N--HNHR1

Н

R

Д I

ю-с=о

X

\ H2NR< IV

ч

Действительно 11996,1998,3278,3281 ], электронодонорные заместители в анилиновом кольце замещенных анилидов N-ацетилтирозина увеличивают каталитическую константу (р>*-2,0). Однако детальное исследование t200i] большой серии соединений, для которых значения рйа уходящих групп варьируют в очень широких пределах, показало, что на самом деле такой зависимости нет (см. также разд.4.3.2.2). Наблюдавшаяся ранее зависимость, по-видимому, является артефактом, обусловленным узкими пределами значений рйа и значительной степенью непродуктивного связывания анилидов [2000].

Представления о предпереходном переносе протона были подвергнуты критике [1999,2302,3282,3283)- Указывалось, что такой механизм не согласуется с отсутствием влияния отщепляемой группы на Кт, а также что требуемые этим механизмом скорости переноса протона (1013-1014 с-1) недостижимы. В свете современных данных об отсутствии у сериновых протеаз системы переноса заряда эта концепция может быть признана несостоятельной.

Доводы в пользу образования тетраэдрического промежуточного соединения при катализе амидгидролазами были получены [1515,3284-3286] при изучении кинетического изотопного эффекта с помощью введения 15N или 180 в уходящую группу субстрата (см.обзор: [1405]). Основные выводы этих работ заключаются в том, что при гидролизе эфирных субстратов химотрипсина лимитирующей стадией является образование тетраэдрического промежуточного соединения, тогда как при гидролизе амидов лимитирующей стадией является преимущественно распад этого соединения (3287,3288). В случае гидролиза бензоиларгининамида папаином изотопный эффект (14N/15N) согласуется с лимитированием гидролиза стадией распада тетраэдрического промежуточного соединения (3289). Действительно, в случае субстратов с низкоосновными уходящими группами (эфиры, ангидриды) вероятность протонирования двух потенциальных уходящих групп

О"

-C-0R

I

близка, величина &_2/&3 [формула (3)] будет большой, а распад тетраэдра в направлении ацилфермента может быть медленным №3). В случае алифатических амидов (пептидов) О"

-сн2о-с

-сн2о-

С-]

•NHR'

326 Глава седьмая. Химическая трансформация субстрата

различия в рКа уходящих груш велики, и скорости образования (й2) и распада (&3) тетраэдрического промежуточного соединенея могут быть сравнимы. С этими выводами согласуются данные по зависимости скорости ацилирования (и скорости переноса ацильной группы в ацилферменте на нуклеофильный акцептор) от рйа уходящих груш (или рКа акцептора) (1533,1989,3290-3292).

Аргументы в пользу образования тетраэдрических промежуточных соединений были выдвинуты на основе изучения реакций пептид-альдегидов, кетонов и ингибиторов - "аналогов переходных состояний" (см. разд.5.8.7) с амидгидролазами (3293-3298). Образование этих промежуточных соединений удалось установить в криоэнзимологических экспериментах на основе кинетических и спектральных данных (3299-3302), однако трактовка последних вызвала сомнения [3303З-

Сам факт образования тетраэдрических соединений в ходе катализа и особенно кинетическая значимость их остаются предметом дискуссий. Так, высказывалось мнение [1501], что катализируемый сериновыми протеазами гидролиз пептидов (но не зфиров или анилидов) происходит по механизму типа S^. С этим согласуются данные (3304) по изотопному эффекту гидролиза 4-метоксифе-нилформиатов химотрипсином, указывающие на промежуточную между sp2 и sp3 гибридизацию карбонила в переходном состоянии.

Основываясь на значительном увеличении рйа уходящей группы при образовании тетраэдрической конфигурации карбонильного углерода (см. разд.3.3.3), можно предположить, что перенос протона с имидазола на уходящую группу происходит еще до сформирования тетраэдрического промежуточного соединения, поскольку уже на ранних этапах его образования происходит выравнивание значений рйа имидазола и уходящей группы. Однако изучение методом 13С-ЯМР комплексов трипсина с галоидметилкетонами (1160,3305) и рН-зависимости ингибирования химотрипсина этими веществами [3298) показало, что рКа имидазола в гидратированных комплексах, моделирующих тетраздрическое промежуточное соединение, не менее 10.

Таблица 77. Энергии различных взаимодействий тетраэдрического соединения, образованного АсТгрХ и химотрипсином [3306]

Вз аимодейс твие дЯ , ккал/моль о Разница

i-форма .D-форма (i-D)

Связывающая энергия 19,5 19,5 0

0"-атом с NH- Gly193 и СО- Met192 -5,3 -4,7 -0,6

0~-атом с NH- Sen 95 и СО- Asp194 -5,2 -3,2 -2,2

0~-атом с СО- Ser214 0,6 0,8 -0,2

NH- Ас с NH- Gly193 и CO- Met192 -0,1 0,2 -0,3

NH- Ac с NH- Ser195 и CO- Авр194 -0,1 0,1 0,2

NH- Ac с CO- Ser214 -1,8 0 -1,8

Другие Ван-дер-ваальсовы взаимодействия -113,6 -111 ,0 -2,6

Все несвязывающие взаимодействия -125,5 -117,8 -7,7

Все связывающие и несвязывающие взаимодействия -106,0 -98,3 -7,7

7.8. Перенос протона и распад тетраэдрического соединения 327

Тетраэдрическое промежуточное соединение в тех случаях, когда оно образуется, должно быть стабилизировано большим числом взаимодействий с ферментом. Методами молекулярной механики были рассчитаны энергии таких взаимодействий для производных N-ацетил-!- и D-триптофана (табл.77). Значительный вклад в стабилизацию тетраэдра вносят взаимодействия в оксианионной полости фермента (3306,3307). Если допустить, что тетраэдрическое промежуточное соединение моделирует переходное состояние реакции, то полученная разница -7,7 ккал/моль для I- и D-форм объясняет различие в скоростях ацилирования фермента стереоизомерными производными ацетилтриптофана.

Косвенные оценки константы равновесия при образовании тетраэдрического промежуточного соединения дают величину порядка 10~6 [3254). Однако эти оценки могут преуменьшать стабильность тетраэдра, особенно для специфических субстратов.

7.8. Перенос протона и распад тетраэдрического промежуточного соединения

Распад тетраэдрического промежуточного соединения (или реакция) может про8исходить лишь в том случае, если уходящий амин присоединит протон. Уход амина в виде аниона невозможен из-за очень высокого значения рйа сопряженного основания:

f

I II

R—С— ОН —*- R—С—ОН + R'NH,

R—С—ОН + °1SHR4

В неферментативных условиях распад тетраэдрических промежуточных соединений катализируется общими кислотами. Такой же катализ должен наблюдаться и в случае ферментативного гидролиза.

У сериновых и цистеиновых амидгидролаз донором протона является сопряженная кислота имидазола (Hls57 у химотрипсина) - имдцазолий-катион (2350). Следовательно, необходимо допустить синхронную атаку гидроксил-ионом и перенос протона на имидазол с последующим перемещением протона от имидазолий-иона на уходящую группу:

R 0/ .0 Н-0' b О ч R_J_

^ V-^ ь-и А_о _> _с/> Ч_ R_c_o-

Nr....kjj/ Jjhr. Nr....тО»н j^.

-c:

o<

¦c-o-l*

Nr....HN^ HL,

2+

Возникает вопрос, не может ли протон быть перенесен прямо с серинового

328 Глава седьмая. Химическая трансформация субстрата

гидроксила на уходящую грушу. Выше было показано, что такой процесс в предпереходном состоянии невозможен (см. разд.7.7). Это обусловлено, главным образом, большим различием в рКа спиртового гидроксила и амидного азота. В соответствии с уравнением (14) (см. разд.3.3.3), скорость такого переноса должна быть:

lgfe - 10 -(13,5-(-2,5)] = -5,5,. т.е. fe-3-Ю"6 М~1С~1.

Однако очевидно, что по мере образования тетраэдрического промежуточного соединения pifa атома азота уходящей группы будет увеличиваться. Как было показано выше (см. разд.7.6), атака спиртовой грушой карбонильного углерода субстрата не может завершиться образованием ковалентной связи без отрыва

о

протона и достигает равновесного О-С-расстояния »1,6 А, которое соот-

ветствует степени пиримидализации амидной группы Aci*0,23 А. При этом значении, как показывают расчеты, величина рйа уходящей группы составит около 6,5 (1500).

Исходя из нормальных значений рХа имидазола, развивались представления (1790,3024,3309,3310) о синхронном переносе протона с гидроксила серина на уходящую грушу, включающие переходное состояние типа:

His 57

/ Ser 195

HN ^N-^-H— О

>

RNH— С —R

II

О

Однако такое четырехчленное циклическое переходное состояние маловероятно по стерическим причинам.

Если же рКа имидазола, как это предполагается (1160,3028,3160,3298, 3305), увеличивается в тетраэдрическом промежуточном соединении на 2-3 единицы, образование этого соединения может полностью завершиться. Расстояние между атомами азота имидазола и уходящей группы в тетраэдре, судя по данным кристаллографии комплексов сериновых протеаз с ингибиторами -"аналогами переходных состояний", все же оказывется очень большим для эффективного переноса протона (3308). Кроме того, как показывают квантово-химические расчеты [33111, перенос протона от О^-атома Ser195 на Г}е2-атом His57 сопровождается резким снижением энергии системы, и последующий отрыв протона должен быть связан с преодолением значительного активационного барьера.

Существует две возможности дальнейшего протекания процесса: 1) конформационные флуктуации в области активного центра, сближающие донор и акцептор протона (3308), и 2) участие в переносе протона промежуточного акцептора-донора, молекулы воды (ззп):

7.8. Перенос протона и распад тетраэдрического соединения 329

-His 57

W

f' n—н...0,

Asp 102

О'

II-

¦о.

\

н

r'hn-c(r)—о

\

Ш2—Ser 195

Квантово-химический анализ согласуется с обеими возможностями. Устойчивость тетраэдрического промежуточного соединения определяется, с одной стороны, его "сольватацией", т.е. взаимодействием оксо-аниона с дипо-

тью общего кислотного катализа его распада. Эффективность сольватации была исследована на моделях - продуктах взаимодействия сериновых протеаз с пеп-тидоальдегидами [9,2860] и оценивается величиной <Л ккал/моль [91, однако большую часть этой энергии («5 ккал/моль) относят к внутримолекулярному характеру сольватации. Исследование кинетики деацилирования N-ацетилфенилала-нил-(MeTiui-Ne2-Hls57)-химотрипсина [3312] позволило оценить "эффективную концентрацию" общей кислоты (имидазола His57) в ферменте, которая равна «2-10б м. Отсюда следует, что эффективность общего кислотного катализа в ферменте очень велика и существенно выше, чем эффективность этого катализа в модельных системах.

Следует отметить, что перенос протона в реакциях ферментативного гидролиза, по-видимому, может происходить путем туннелирования (см. разд.5.5). С этим предположением согласуются данные по температурной зависимости изотопного эффекта растворителя.

При гидролизе эфиров или анилидов значение рКа уходящей группы остается низким и в тетраэдрическом промежуточном соединении, и, по-видимому, нук-леофильная атака завершается образованием таких соединений. В случае эфиров возможно отщепление уходящей группы в виде алкоголят-иона (рйа«15), и его протонирование в "постпереходном" состоянии.

Как полагают (1476,1518,1519,3313), распад тетраэдра подвержен стерео-электронному контролю (см. разд.3.3.3). Вкратце эта концепция предусматривает сохранение конфигурации связи в ходе ацильного переноса. Иначе говоря, если гидролизу подвергается наиболее устойчивый в растворе эфир, имеющий Z-конфигурацию, то образовавшийся ацилфермент должен также иметь Л-конфигу-рацию. Это может происходить лишь в том случае, если конформация промежуточного тетраэдрического соединения такова, что отщепляемая группа имеет максимальное число антиперипланарных орбиталей по отношению к двум остальным группам тетраэдра (см. рис.35). Ситуация при химотрипсиновом катализе, возможно (1406], отвечает показанной на рис.111 и предусматривает существование стадии изомеризации промежуточных тетраэдрических соединений.

В случае папаина образование тетраэдрического промежуточного соединения при гидролизе амида было установлено на основании величины 1^-изотопного

лями NH-связей (Gly193 и Ser195 в химотрипсине), а с другой - эффективное-

330 Глава седьмая. Химическая трансформация субстрата

Рис.111. Схема ацилирования химотрипсина [1406], включающая стадии изомеризации промежуточных тетраэдрических соединений

эффекта. Отличие папаина от сериновых протеаз в этом отношении может иметь две причины. Во-первых, рКа Hls159 резко снижается в отсутствие заряда на атоме серы (см. разд.7.1), что ведет к понижению концентрации имидазолий-ионов в оптимуме действия фермента (pH>*G). Во-вторых, как это следует из анализа моделей комплекса папаина с субстратом (см. разд.6.5.3), в этом комплексе имеются неблагоприятные контакты уходящей группы с а-СТ^-группой Hls159. Это "давление" снимается в тетраэдрическом комплексе. Возможно, поэтому уже в основном состоянии фермент-субстратного комплекса расщепляемая -вязь довольно сильно искажена в сторону тетраэдрической (высокая степень

7.8. Перенос протона и распад тетраэдрического соединения 331

пирамидализации), так что атака сильным нуклеофилом (тиолат-ионом) завершается быстрым образованием тетраэдра.

Значительно меньше имеется сведений о катализе протонирования уходящей группы у аспартатных амидгидролаз. В случае пенициллопепсина предполагалось [13451 участие в этом процессе гидроксильной группы остатка Туг75. Следует отметить, что перенос протона от фенольной группы тирозина в кислой среде возможен только по эстафетному механизму [33141:

В структуре ферментов этого типа согласно рентгеноструктурным данным нет донорных групп типа АН, за исключением Asp215. Участие этой группы в катализе согласуется с рН-зависимостью реакции (pXES«4,5). Этой группе ранее отводилась лишь роль электрофильного катализатора, поляризующего карбонильную группу субстрата.

По данным исследований комплекса квазисубстрата с пепсином остаток Туг75 расположен вдалеке от места связывания лиганда [31281. Положение же остатка Asp215 вполне согласуется с его ролью в качестве общего кислотного катали-

,Asp215

Asp 32

X

Asp 215

Asp 32

ri

H-.

О

X

РИС.112. Возможный механизм действия аспартатных протеаз, включающий протонирование уходящей группы субстрата путем пер

страница 51
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Химия протеолиза" (8.49Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
mcb 10g 2s
расценки на ремонт и то чиллеров
цирк москва запашных официальный сайт программа
http://help-holodilnik.ru/remont_model_8745.html

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(11.12.2017)