химический каталог




Химия протеолиза

Автор В.К.Антонов

ом кислорода карбонильной группы субстрата [3244,3261,3262]. Карбонильная группа, по-видимому, входит во внешнюю координационную сферу металла, смещая молекулу воды. Это подтверждается неспособностью Со3+-карбоксипептидазы А с ок-таэдрической координацией металла связывать пептиды и эфиры [32631. Аналогично связывание субстрата происходит у термолизина и дипептидилкарбокси-пептидазы [32441- У карбоксипептидазы А и термолизина остатки гистидина (Н1в69 и His142 соответственно), связанные с ионом Zn2+, своим Иег-атомом образуют Н-связь с остатками аспарагиновой кислоты (Asp142 и Asp170), что может влиять на нуклеофильность ассоциированной с Zn2+ воды [3264]-

Роль электрофила аспартатных протеаз приписывалась атому водорода, расположенному между карбоксильными группами остатков Asp32 и Asp215 [13451- В связи со сказанным выше эффективное действие этого атома водорода на расщепляемую связь может быть лишь в том случае, если он протонирует атом кислорода субстрата, а не просто образует с ним водородную связь. Однако расстояние между этим протоном и карбонильным кислородом субстрата, по-видимому, слишком велико для образования прочной водородной связи. Теоретический расчет [32651, основанный на кристаллографических данных, не подтверждает возможности протонирования кислорода расщепляемой группы даже в тетраэдри-ческом промежуточном соединении. Согласно кристаллографическим данным кратчайшее расстояние между гидроксильным кислородом ингибитора, моделирующего

о

тетраэдрическое соединение, составляет 2,7 А [30731-7.6. Нуклеофильная атака. Элементарный акт

Как было показано в разд.7.2, у сериновых протеаз в продуктивном фермент-субстратном комплексе каталитически активная гидроксильная группа находится в нейтральной форме и не может ионизоваться путем переноса тгротона на имидазол Hls57, поскольку "система переноса заряда" отсутствует. Кроме того, хотя карбонильная группа и образует водородные связи с Ш-группами Ser195 и Gly193, эти водородные связи лишь слабо поляризуют карбонил. В такой системе эффективность катализа не может быть высокой. По-видимому, основным фактором, обеспечивающим эффективное протекание реакции, является нарушение резонансной стабилизации расщепляемой связи. Есть все основания предполагать, что уже в основном состоянии реагирующей системы (в продуктивном фер-

320 Глава седьмая. Химическая трансформация субстрата

мент-субстратном комплексе) резонансная стабилизация амидов нарушена, главным-образом, за счет пирамидализации связи (см. разд.6.5.2).

При -некоторой начальной степени пирамидализации, определяемой структурой фермент-субстратного комплекса, дальнейшее уменьшение резонансной стабилизации амида (и увеличении степени пирамидализации) зависит в основном от расстояния между карбонильным углеродом субстрата и От-атомом серинового гидроксила (см. разд.3.3.1). Любая тепловая флуктуация, приводящая к сближению этих атомов, будет, с одной стороны, увеличивать степень пирамидализации амидной группы, повышая положительный заряд на карбонильном углероде и снижая ти-порядки связей C-N и С-О, а с другой - ослаблять связь О-Н в атакующей спиртовой группе, увеличивая тем самым ее нуклеофильность.

Такая флуктуация "автоматически" приведет к возникновению связи 0-С, т.е. образованию тетраэдрического промежуточного соединения. Решающим здесь должно быть состояние амидной связи до начала реакции и исходное расстояние между 0Т (Ser195) и С(карбонил). Можно думать, что специфичность субстрата определяется именно этими двумя факторами, и у наиболее специфических субстратов степень пирамидализации и 07-С'-расстояние в основном состоянии системы оптимальны.

Изложенные представления о прохождении элементарного акта нуклеофильной атаки у сериновых протеаз согласуются с квантово-химическими расчетами

d.A

Рис.108. Зависимость степени пирамидализации (Aq) амидной группы в N-ме-

тилацетамиде от расстояния между нуклеофилом и карбонильным С-атомом

/- метанол; 2- метоксианион;

3- метилтиолатанион;

4- вода, формиат-ион [1477]

[1477,3266,32671. Изменения степени пирамидализации амидной группы в зависимости от расстояния между различными нуклеофилами и карбонильным атомом углерода было рассчитано полуэмпирическим методом CND0/2 (рис.108).

о

Экстраполяция полученных прямых на расстояния, превышающие 2,5 А, показывает , что даже на таких расстояниях наблюдается индуктивное влияние заряженных нуклеофилов на состояние гибридизации карбонильного С-атома, приводящее к' энергетически предпочтительной, частично пирамидализованной структуре амидной группы. В случае спиртового гидроксила на расстояниях, соответствующих сумме Ван-дер-ваальсовых радиусов спиртового кислорода и карбонильного

о

углерода (около 3,2 А; см. табл.66), степень пирамидализации все же очень

о

мала (Ас<0,007 А). Можно, однако, предположить, что в случае "хороших" субстратов взаимодействия нереагирующих групп субстрата с ферментом могут привести к тому, что это расстояние в продуктивном фермент-субстратном комплексе будет меньше суммы Ван-дер-ваальсовых радиусов (ср. (32681).

На рис. 109 показано изменение потенциальной энергии системы при взаимо-

7.6. Нуклесфильная атака. Элементарный акт

321

действии метоксианиона и спиртового гидроксила с амидной связью N-метил-ацетамида. Следует подчеркнуть, что при расчетах сближение реагирующих атомов моделировалось таким образом, что р -орбиталь нуклеофила была направле-

о

на перпендикулярно к амидной группе. При этом на расстояниях около 2-2,3 А наблюдается понижение энергии системы, обусловленное перекрыванием связывающих орбиталей реагирующих атомов. Реакция с метоксианионом завершается образованием ковалентной связи, тогда как в случае метанола понижение энергии

РИС.109. Изменение потенциальной енер-гии при атаке метоксианионом (1) и метанолом (2) карбонильного атома углерода в N-метилацетамиде [1477]

системы оказывается существенно меньшим и равновесная степень пирамидализации

о

составляет 0,22 А (в тетраэдре Д =0,47 о с А). Порядок связи между спиртовым кислородом и карбоксильным углеродом составляет в минимуме потенциальной кривой лишь 0,5.

Это соответствует расстоянию 0-С

о

около 1,6 А, и равновесная структура в этом случае может быть представлена формулой:

СН_—С—NHCH. 6е-

Дальнейшее продвижение системы по координате реакции невозможно без отрыва протона. Однако в системе создаются все предпосыжи для акцептирования протона подходящим основанием, поскольку состояние атакующей группы близко к таковому у оксоний-катиона. Интересно 'отметить, что по данным рентгено-структурного анализа комплекса трипсина и панкреатического трипсинового ингибитора [3044] расстояние между сериновым гидроксилом и карбонильным углеродом остатка Iys15 также больше длины ковалентной связи. Более того, расстояние между ОТ-атомом и Г}е2-атомом His57 в комплексе фермента с "пирами-дализованным" субстратом, как показывают исследования комплексов трипсина и химотрипсина с белковыми ингибиторами [3044], становится достаточно близким для образования хорошей водородной связи, что обеспечивает дальнейший перенос протона на имидазольный остаток.

Таким образом, нуклеофильную атаку на карбонильный углерод субстрата можно представить себе как "саморазвивающийся" процесс, при котором любое продвижение по координате реакции способствует дальнейшему взаимодействию реагирующих атомов. Следует подчеркнуть, что выделение промежуточных состояний на пути от основного состояния системы к переходному лишено смысла,

21 В.К. Антонов

Л Н, ппал/моль

~ts ~tb ?J djt

322

Глава седьмая. Химическая трансформация субстрата

если процесс представляет собой действительно элементарный акт, происходящий за время флуктуации, т.е. за время порядка 10~1г-1СГ13 с. Поэтому эффективность процесса в данном случае должна зависеть только от начального (основного) состояния системы - сближенности нуклеофила и карбонильного углерода и степени дестабилизации расщепляемой группировки. Этим, по-видимому, ферментативная реакция отличается от неферментативной, где удерживание реагирующих компонентов в положении, максимально благоприятном для реакции, невозможно из-за свободного теплового движения молекул. Фермент, следовательно, создает "рамку" или "коридор", направляющий элементарный акт строго по пути реакции.

Тот факт, что многие ферментативные реакции проходят с диффузионно-контролируемыми скоростями (см. разд. 4.4), является убедительным свидетельством весьма низких энергий активации собственно элементарного акта химического превращения субстрата. Для "идеальных" субстратов энергия активации этого акта, по-видимому, всегда ниже энергий активации диффузионно-контролируемых реакций (<*5 ккал/моль).

Сходной точки зрения на механизм нуклеофильной атаки у сериновых протеаз придерживается ряд других исследователей (1330,3044,3045,3060,3062,3103, ЗЮ4). Интересно отметить, что расщепление р-лактамного цикла в бензилпе-нициллине р-лактамазой из Escherichia coll происходит с константой скорости второго порядка (fe^^/K^M-Ю8 М-1 с-1, т.е. со скоростью, близкой к диффу-зионно-контролируемой. Однако эффективность этого фермента № /К k =109; см. табл. 50) не превышает эффективности других амидгидролаз. р-Лактамное кольцо в пенициллинах уже практически лишено резонансной стабилизации (см. разд.1.3.1), и механизмы дестабилизации расщепляемой связи у этого фермента, по-видимому, не должны функционировать. Остается важный фактор эффективности - ориентация, т.е. расстояние между нуклеофилом фермента и карбонильным углеродом, которое должно быть оптимальным для эффективного катализа. Вероятно, невыполнение этого условия и приводит к низкой скорости гидролиза других неспецифичных для этого фермента субстратов.

Аналогичным образом, по-видимому, происходит атака субстрата тиолат-ионом в цистеиновых протеазах. Интересно отметить, что "искусственный" фермент тиолсубтилизин неактивен в отношении специфических субстратов, но скорость деацилирования арилакрилоилпроизводных (полученных ацилированием по SH-группе арилакрилоилимидазолами) выше, чем скорость деацилирования ацил-субтилизинов (32693. Эту особенность объясняют более низкой нуклеофильнос-тью тиолат-иона по сравнению с оксо-анионом, однако причины могут быть значительно сложнее (3270).

У аспартатных протеаз нуклеофильным агентом служит молекула воды. Крайне низкая нуклеофильность' воды практически исключает эффективную атаку резонансно-стабилизированной амидной группы. В1 то же время ионизация путем переноса протона на карбоксилат-ион - процесс термодинамически невыгодный и может происходить лишь с очень низкой скоростью. Поэтому перенос протона и нуклеофильная атака должны происходить синхронно, в едином элементарном акте

.о н—О 1 с=о

—с:

н

7.6. Нуклесфильная атака. Элементарный акт

323

Положение здесь в 1гринципе аналогично положению в сериновых протеазах с той только разницей, что имидазол является более эффективным акцептором протона, чем карбоксилат-ион. Во всех случаях синхронного элементарного акта необходимо, по-видимому, учитывать величину коэффициента синхронизации (см. разд.3.4.9), который ограничивает число возможных синхронных перемещений тяжелых атомов в одном элементарном акте. Оценить эту величину для ферментативных процессов указанного типа довольно трудно, поскольку неизвестна величина энергии активации синхронного процесса. При Ес=0 максимальное число атомов, участвующих в синхронном элементарном акте, вряд ли может быть больше восьми [3271,3272].

Существует в принципе другая возможность, базирующаяся на изучении общего основного катализа в модельных соединениях [3273-32751, когда нуклео-фильная атака и перенос протона проходят через два последовательных пере-

РИС.110. Движение протона по поверхности потенциальной энергии при общем основном катализе присоединения воды к карбонильной группе [3275]

ходных состояния (рис. 110). Определяющее скорость всего процесса присоединение воды, облегчаемое дестабилизацией расщепляемой группы, не сопряжено с ¦ переносом протона на общее основание. Возникающее при этом первое переходное состояние характеризуется наличием водородной связи с общим основанием. Дальнейшее движение нуклеофила по координате реакции приводит ко второму переходному состоянию, где завершено образование нормальной связи нуклеофила с карбонильным углеродом, а протон, двигаясь также по координате реакции (так как он связан с общим основанием), оказывается на "полпути" к акцептору. Реакция завершается быстрым переносом протона на общее основание. Этот механизм согласуется с наблюдаемым кинетическим изотопным эффектом растворителя, так как существенной его особенностью является наличие Н-связи нуклеофила с общим основанием.

Если правильны представления о том, что в металлзависимых протеазах нук-леофилом является координированная с ионом Zn2+ вода и в координационную сферу металла входит карбонильный кислород субстрата, то у этих ферментов не возникает проблем, связанных с ионизацией нуклеофила и поляризацией карбонильной группы. Возможно., именно поэтому в фермент-ингибиторных комплексах металлзависимых протеаз пирамидализация амидной группы менее существенна, чем в сериновых ферментах.-

Квантово-химические.исследования (3276] показывают, что атом цинка может играть роль не только в поляризации карбонильной группы, но и в стабилизации промежуточного тетраэдрического соединения, нейтрализуя возникающий отрицательный заряд и делая связи с.центральным атомом углерода более прочными.

324 Глава седьмая. Химическая трансформация субстрата

7.7. Промежуточное тетраэдрическое соединение

Нуклеофильная атака на карбонильный углерод субстрата завершается образованием тетраэдрического промежуточного соединения. Эти промежуточные соединения были идентифицированы при неферментативном гидролизе, главным образом, на основании результатов опытов по включению 180 из тяжелокислородной воды в субстрат (см. разд.3.3.2).

Альтернативным механизмом, не включающим образование тетраэдрического аддукта, является механизм типа S^:

R ? |~AH^,NHR4 |-A- NH2Ri

Выбор между этими механизмами в случае ферментативного гидролиза достаточно сложен. Так, попытки обнаружить включение 180 в субстрат в ходе химо-трипсинового катализа, что свидетельствовало бы об образовании тетраэдрического промежуточного соединения, оказались безуспешными (3225]. Однако отрицательный результат здесь может свидетельствовать лишь о неблагоприят-

R К R k R k 0 E-OH + C=0 ^ S ~ E-OH.Lo ^—E-O-C-O"---. E-O-C-R.

NHR' NHR' к'г NHR' +

NHgR'

В этом случае наблюдаемая константа скорости образования ацилфермента

kns. = - (3)

и при k3»k_z feac=fe2. т.е. обмен практически наблюдаться не будет.

В реакциях, катализируемых лейцинаминопептидазой и пепсином, наблюдается значительное включение 180 в непрогидролизованный субстрат [3228,3231]. Детальное исследование этой реакции показало, что это включение является следствием реакции транспептидации, т.е. переноса ацильного фрагмента субстрата на образующ

страница 50
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Химия протеолиза" (8.49Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
коттеджные поселки на новой риге эконом класс
ремонт двери автомобиля фото
агрегат вентиляторный вран9-2,5 технические характеристики
купитьчерные розы по скидке

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(09.12.2016)