.е. образования из ацилфермента нового производного субстрата путем переноса ацилыюго фрагмента на нуклеофильный акцептор:

33-X-COR + RYR1 -> Е-ХН + R1YC0R.

Эти реакции можно изучать кинетически, измеряя отношение fccat/Km для гидролиза субстрата в присутствии нуклеофильного акцептора. В случае если перенос имеет место, то константа скорости второго порядка зависит от концентрации акцептора:

К

fe2(H203

Е + RC0XR1 ^-» E-RC0XR1 —

Е + RC00H + R1XB

Е + RCOYR2 + R1XH

fc3[RTR23

ft . ЙЛЬЦОЗ + ft [RYR2] cat Н Н 3

к к

т в

Хорошим нуклеофилом для таких измерений является 1,4-бутандиол [1723З.

Этот способ был успешно применен для идентификации ацилфермента при гидролизе эфиров бензоилглицина химотрипсином (HYR2 - гидроксиламин) (3198, 32123, однако его использование для доказательства образования ацилфермента при гидролизе амидов ациламинокислот химотрипсином натолкнулось на определенные трудности (ср.[3213З и [32143). Лишь в 1973 г. этим методом были получены [14123 однозначные данные в пользу образования ацилфермента при хи-мотрипсиновом гидролизе амидов. Эти же методы были использованы для доказательства промежуточного образования ацилферментов при катализе (3-лактама-зой [18563, Р-аланилкарбоксипептидазой [2180,32153 и катепсином В (32163. Для идентификации лимитирующей скорость стадии было также предложено (3217 3

314

Глава седьмая. Химическая трансформация субстрата

определять температурную зависимость k . и k ./К . Эти две величины оди-каково изменяются с температурой, если медленной стадией является ацилиро-вание фермента.

Использование метода "перехвата" и, в частности, его разновидности - реакции транспептидации [2169,2177,3218-3221], привело исследователей к убеждению о существовании "ацилфермента" (ангидрида E-CO-0-COR) и "аминофермен-та" (E-CONHR1) при гидролизе пептидов пепсином и другими аспартатными про-теазами. Образование "аминофермента" подтверждалось также исследованием начальных скоростей транспептидации субстратов, имеющих одинаковую переносимую группу (см. разд.4.8.1). В дальнейшем было показано, что такие кова-лентные промежуточные соединения при катализе пепсином не образуются. Следовательно, метод "перехвата" не всегда способен различить ковалентные и устойчивые нековалентные промежуточные соединения.

Еще один способ, имеющий, впрочем, тот же недостаток, основан на изучении упорядоченности отщепления продуктов гидролитической реакции по характеру ингибирования продуктами (см. разд.5.8.3). Этот метод использовался [2175,2587,26041 для анализа механизма действия пепсина, однако полученные результаты были подвергнуты критике [2588].

Предпринимались также попытки вынести суждение об образовании ковалент-ных промежуточных соединений на основе соотношений линейности свободных энергий [2010,2012,2013]. Такой анализ ограничивается системами, для которых известны стандартные изменения свободной энергии, и несвободен от ряда произвольных допущений.

Наконец, изучение влияния модификации фермента на амидазную и эстеразную активности может дать информацию о сходстве или различиях в механизмах гидролиза амидов и эфиров. Однако и этот метод дает далеко не однозначные результаты (ср. [3222] И [32231).

На мой взгляд, наиболее надежными методами установления типа катализа являются методы, основанные на изучении включения тяжелого кислорода из Н?80 в субстрат, продукт транспептидации или продукт гидролиза.

Действительно, механизмы (1) и (2) отличаются тем, что в первом случае вода участвует в реакции на стадии гидролиза ацилфермента, а во втором - на первой химической стадии процесса. Важным условием является то, что реакция идет по механизму ацилкислородного расщепления, установленного для модельных систем (см. разд.3.3) и для гидролиза эфиров некоторыми протеазами [32241.

Включение 180 в субстрат можно изучать как в стационарном режиме [3225-32281, так и в условиях равновесия И729Э. В первом случае метка 180 может включаться в субстрат, лишь если вода участвует на первой химической стадии реакции, т.е. реакция идет по механизму (2). Здесь положительный результат свидетельствует о механизме (2), но отрицательный - не дает оснований для выводов, поскольку отсутствие включения в субстрат может быть следствием неблагоприятного соотношения скоростей образования (&2) и распада (&3) промежуточного тетраэдрического соединения:

- . I *1 Л - *з

Е-Х H-Q 6-0 - . Е-ХН-Н*0-С-0 -> продукты.

Н NHR1 Ьг HHR1

7.4. Ковалентный или общий основной катализ

315

Если реакция идет через образование ацилфермента и система находится в термодинамическом равновесии:

Н*0

Е + RCONHR1 === Е-RCONHR1-— E-C0R «. Е + RC0*0H,

+

R1NH2

то скорость включения 180 в субстрат из Н280 не может превышать скорости включения в субстрат ацилыюго продукта реакции, а скорость включения R1!^ может быть существенно выше этой величины, так как последнее происходит независимо от включения 180.

Если же реакция идет без образования ацилфермента:

Е + Н*0 + RCONHR1 ^» Е-RCONHR1 -Н*0 E-RCO*OH Е + RCO*OH,

+

R1NH2

то включение 180 в субстрат должно происходить с такой же скоростью, с какой включается R'NH2. Используя радиоактивные продукты реакции и измеряя скорость включения радиоактивных меток и 180 из тяжелокислородной воды в субстрат при различных, но равновесных концентрациях субстрата и продуктов (метод Бойера, см. разд.4.5.1), было показано (1729-1731], что в ходе гидролиза AcPheGlyNH2, катализируемого химотрипсином, реализуется первая из рассмотренных возможностей, т.е. реакция идет через ацилфермент.

По тем же . причинам в случае механизма (1) не следует ожидать включения 180 из Н180 в продукты ацилыюго переноса или транспептидации, а если реакция идет по механизму (2), то такое включение должно наблюдаться. В табл.75

Таблица 75. Включение 180 в продукты транспептидации [2040,3229,3230]

Фермент Исследуемая реакция Форма анализируемого продукта* Обмен, %

Химотрипсин Папаин Карбоксипептидаза Y Пепсин Лейцинамино-пептидаза Термолизин *Tfa - тр вещества использо) **Использо 2ЪеиЪеиИН2 -> (Leu)3+LeuNH2+NH3 ZGlyNH2+LeuGly —ZGlyLeuGly+NH3 ZGlyOMe+LeuGly —ZGlyLeuGly+MeOH ZPheOMe+HLeuNH2 —ZPheLeuNH2+Me0 ZPheAlaOH+HLeuNH2 —ZPheLeuWH2+Ala 2LeuTyrNH2 —> (Leu)2+2TyrNH2 2LeuNH2 —•LeuLeuNH2+NH3 2LeuLeuNH2 — (Leu>2+2beuNH2 ифторацетил, TMS - триметилсилил; исследованы масс-спектрометрическ валась вода, содержащая 60-80 атом; вался 180-LeuNH2 и Н^О. Tfa(Leu)30Me ZGlyLeuGlyOMe ZGlyLeuGlyOMe ZPheLeuNH2 1 ZPheLeuNHg TMS(Leu)aOTMS beuLeuNHg 180-beuLeuUH2 Tfa(Leu)?OMe H" 1R rtttt % 1B0. 0 0 \ о 0 0 56±10 46±5 55±5 47±5

316

Глава седьмая. Химическая трансформация субстрата

приведены данные, полученные [2040,2189,2574,3227-3232] при исследовании этим методом гидролиза, катализируемого различными амидгидролазами. Все эти результаты показывают, что сериновые и цистеиновые протеазы функционируют по типу ковалентного (1), а аспартатные и металлсодержащие протеазы - по типу общего основного (2) катализа на стадии атаки субстрата молекулой воды.

Уже давно было показано (разд.4.8.2), что многие амидгидролазы катализируют обмен кислорода в ацилыюм продукте гидролитической реакции. Само это обстоятельство некоторые авторы (2183,3233,3234] склонны рассматривать как свидетельство образования ацилфермента, другие же (2188] считают, что этот обмен может быть следствием синтеза (из ациламинокислоты и пептидов - продуктов автолиза или отщепления ацилыюй группы) нового пептида и последующего его гидролиза. На самом деле такие ферменты, как пепсин и лейцинамино-пептидаза, функционирующие по механизму (2), способны катализировать 180-обмен в ацилфенилаланине и лейцине:

r r r

• в „ 0 1 н?» I ©

е—x—с—о i^e-x + с=0 е—хн-н»—с—о

I I I

он он он

It и

r r r

I Н2« 0 I © I

е—x—0=0 :з=Ь: е—x + с=» 2=Z е—x ¦ с=»

он

он

r r ^r,nh2

е—xenhr, nhr,

Как видно из схемы, добавление аминного продукта реакции (RjNHg) должно увеличивать скорость обмена 180 в ацильном продукте лишь в случае, если реакция идет по механизму (2), за счет параллельно протекающего процесса синтеза-гидролиза пептида. Как видно из данных табл.76, катализ пепсином, лей-цинаминопептидазой и карбоксипептидазой А идет именно по этому механизму.

Очевидно, что вклад синтеза-гидролиза может быть заметным, лишь если его суммарная скорость сравнима со скоростью собственного обмена. Это видно на примере системы HLeuOH + NH С1, где ускорение аммиаком не превышает ошибки опыта, поскольку скорость синтеза-гидролиза весьма низкая.

Все эти методы позволяют судить о наличии или отсутствии ацилфермента, но для суждения о промежуточном образовании "аминофермента" (E-CONHR) они непригодны.

Для этого необходимо убедится в отсутствии включения 180 в карбоксильные группы активного цетра фермента, которое должно происходить при гидролизе аминофермента:

E-CO*NHR1 + Н*0 -» Е-СО*ОН + NH2R1.

Отрицательные результаты в отношении включения метки в фермент в ходе гидролиза субстратов пепсином были получены при анализе продуктов, получающихся при мягком гидролизе специфически ингибированного фермента [2189,

7.4. Ковалентный или общий основной катализ

317

25743:

Е-СО*ОН + N2CHCOR1 -* E-C0*0CH2C0R1 -* Е-СООН + H*OCH,,COR1,

а также методом прямого масс-спектрометрирования фрагментов пепсина и карбоксипептидазы А после их инкубации в Н280 в присутствии субстратов [3236].

Сходные методы были использованы для выяснения механизма действия амино-ацилазы из почек свиньи [32371, аспарагиназы [32381, а также ферментов других классов [32391-

Таблица 76. Скорость обмена кислорода, катализируемого пепсином, лейцинаминопептидазой и карбоксипептидазой А [2189,3228,3235]

Фермент Субстрат Экспериментальное значение V , обмена,макс М.мин-1 Вычисленное значение скорости обмена за счет синтеза--гидролиза , М-мин-1

Пепсин AcPheOH AcPheOH+HPhe(Ala)ОМе 2,5-Ю"5 5.6.10"5 7,8.10-5

Лейцинамино-пептидаза HLeuOH HLeuOH+NH.Cl 4 rlbeuOH+HLeuMH (CH"2) 20H 1 ,6-Ю"3 1 ,8-10~3 3,5-Ю"3 8,3-Ю"6 1 ,2.10~3

Карбоксипептидаза А AcPheOH AcPheOH+HPheOH З,3-Ю~б 11 ,6-10~б 9,9-Ю"6

'Вычислено по формуле (1) в работе [2188] ¦

Таким образом, у сериновых протеаз каталитически активная гидроксильная группа Ser195 является группой, атакующей расщепляемую связь амидных и эфирных субстратов. То же самое справедливо и для SB-группы остатка Сув25 цистеиновых ферментов.

Атакующим нуклеофилом в случае аспартатных протеаз является молекула воды. Нуклеофильные каталитические группы этих ферментов выступают в качестве общих основных катализаторов, способствуя отщеплению протона от молекулы воды. Следует отметить, однако, что результаты опытов по включению 180 в продукт транспептидации, катализируемой пепсином, ставились под сомнение (32401 и объяснялись сложной последовательностью реакций синтеза-гидролиза. Несмотря на это, общий основной катализ на стадии нуклеофильной атаки является в настоящее время общепризнанным.

В отношении карбоксипептидазы А, несмотря на многочисленные данные в пользу общего основного катализа атаки водой, связанной с ионом Zn2+, при гидролизе как амидных, так и эфирных субстратов (3241-32441, приводятся аргументы, основанные, главным образом, на данных криоэнзимологии (см. разд. 5.7), в пользу промежуточного образования ангидрида между ацильным фрагментом субстрата и карбоксильной группой остатка Glu270 (2523,3206,3245-32481. Для лейцинаминопептидазы и термолизина [26951 сомнений в общем основном катализе не возникает.

318

Глава седьмая. Химическая трансформация субстрата

Для аминопептидазы М было постулировано участие февольной оксигруппы ти-розинового остатка в качестве нуклеофила, непосредственно атакующего субстратный карбонил и образующего с ацильным фрагментом субстрата сложноэфирную связь (ацилфермент) (32491.

Были получены данные, указывающие на ковалентный катализ при гидролизе пепсином сульфидных эфиров [3221,3250,3251], однако они нуждаются в проверке.

Следует отметить, что участие карбоксильной группы в качестве кова-лентного катализатора представляется мне маловероятным. Хотя имеются модели, где карбоксилат-ион выполняет именно эту функцию (см. разд.3.4.5), такие случаи ограничены образованием относительно устойчивых циклических ан-гадридов. Сравнение тетраэдрических промежуточных соединений, образованных карбоксильной группой и гидроксил-ионом, показывает, что- распад первых в направлении исходных соединений должен быть значительно более эффективным (низкая основность СОО~-группы), чем во втором случае:

OR OR -0-С-0" Е-Л-ОН•НО-С-0".

R' NHR'

7.5 Электрофил

Одним из способов увеличения реакционной способности производных карбоновых кислот в гидролитических реакциях является электрофильный катализ. Этот тип катализа направлен на атом кислорода карбонильной группы и вызывает перераспределение электронной плотности так, что положительный заряд на атоме углерода увеличивается:

Ч

-С—N11-

В случае сериновых протеаз, как уже отмечалось (см.разд.б.б^З), карбонильный кислород в фермент-субстратном комплексе занимает место в так называемом оксианионном кармане, образуя водородные связи с NH-группой Gly193

о о

(«2,8 а в химотрипсине) и NH-группой Ser195 (3,2 а).

Сами по себе такие водородные связи не могут эффективно поляризовать карбонильную группу субстрата. Квантово-химические расчеты показали, что заряды на атомах амидной группы практически не меняются при образовании водородной связи карбонильным кислородом. Лишь протонирование карбонильного кислорода существенно изменяет заряды на атомах С, N и О, а также порядки связей С-0 И С—N (3252).

Роль этих связей возрастает при образовании промежуточного тетраэдрического соединения, в котором карбонильный кислород приобретает целый отрицательный заряд. Появление заряда в неполярном окружении активного центра фермента крайне невыгодно. Однако наличие двух диполей N-H вблизи заряда значительно компенсирует эти энергетические потери (3253-3257I—

7.6. Нуклеофильная атака. Элементарный акт

319

Предполагалось, что аналогичную роль у цистеиновых протеаз играют NH-группа Cys25 и амидная группа боковой цепи остатка Gln19 [3258]. Следует, однако, отметить, что сравнение скоростей гидролиза кислородных [RC^JOR'l и тионовых [RC(-S)OR'l эфиров сериновыми и цистеиновыми амидгидролазами [3259, 3260] ставит под сомнение роль этих взаимодействий в стабилизации тетраэдрического промежуточного соединения цистеиновыми ферментами. В то время, как сериновые протеазы не способны гидролизовать тионовые эфиры из-за размеров атома серы, не позволяющего тиокарбонильной группе правильно разместиться в оксианионной полости, цистеиновые ферменты одинаково хорошо гидролизуют оба типа эфиров.

У металлзависимых ферментов роль электрофила, по-видимому, играет ион Zn2+. Этот ион в карбоксипептидазе А и других сходных ферментах может включать в свою координационную сферу не только молекулы воды, но и ат