им группам будет пересмотрено.

Данные табл.73 показывают, что потенциальные нуклеофильные группы многих ферментов или находятся в оптимуме рН действия данного фермента в очень низкой концентрации заряженной формы, как, например, сериновый гидроксил,

7.2. Системы переноса заряда

307

или же, если и полностью ионизированы, то относятся к числу весьма слабых оснований, обладающих нивкой нуклеофильностью (например, СОО~-группа в аспартатных протвазах)..

Очевидно, должны существовать механизмы, повышающие нуклеофильность (или концентрацию) данной группы или же увеличивающие реакционную способность субстрата по отношению к слабому нуклеофилу.

7.2. Системы переноса заряда

В 1969 г. была предложена И327] весьма плодотворная идея, объясняющая аномально высокую реакционную способность серинового гидроксила в химотрипсине. Кристаллографические данные, а также более тщательное исследование первичной структуры фермента показали, что три функциональных группы - Asp102 (которая раньше считалась остатком Asn), His57 и Ser195 - сближены в пространственной структуре фермента и образуют единую систему, связанную водородными связями:

Н1ч57 Sen 95

0 His57 Т

Aspl02-C^ .СН_.

4)7.-.........HN^......Н-С/ 2

Поскольку карбоксильная группа Asp102 находится в гидрофобном окружении и экранирована от растворителя, было высказано предположение, что ее рКа является аномально высоким, и поэтому система связей может изомеризоваться:

Н1<,™ Sen 95

0 H1S57 ,

Aspio2-cr; .сн_.

ND-H........N^^Jffl......70 2

Аналогичная система была постулирована [1231,1240,3063,3172] для многих других сериновых протеаз. В такой системе заряд с карбоксильной группы может быть перенесен в нейтральной среде на сериновый гилроксил, и последний приобретает весьма высокую нуклеофильность.

В качестве аргумента в пользу наличия такой системы в сериновых протеа-зах рассматравались (3145) данные о том, что ее разрушение путем метилирования Яе2-атома HIs57 в химотрипсине снижает каталитическую активность более чем на пять порядков [1325]. Надо, однако, отметить, что, несмотря на очень небольшие изменения в активном центре, Н1з57-метилхимотрипсин по многим параметрам отличается от нативного фермента (3173), в том числе, например, по устойчивости к денатурации (3174). Таким образом, причина низкой каталитической активности этого производного может быть не связана с разрушением "системы переноса заряда". Более того, в неактивных химотрипсиногене и щелочной форме химотрипсина положение групп, образующих эту систему, такое же, как в нативном ферменте [2290].

Необходимыми условиями переноса заряда должны быть близость значений рйа имидазола и Asp102 и расположение всех атомов, участвующих в образовании системы, оптимальным образом для возникновения прочных водородных связей.

Предпринималось много попыток определить истинные значения рКа групп, входящих в систему переноса заряда с использованием разностного титрования

308 Глава седьмая. Химическая трансформация субстрата

в условиях денатурации фермента [31751, ИК- [23551 и ЯМР-титрования [2349, 2350,3157,3158,31761. Исследования дали противоречивые результаты. Утверждалось [2355,31761, что эти данные согласуются с наличием системы переноса заряда и что группа фермента, ионизирующаяся при рН<*7, принадлежит остатку Asp102, a His57 не протонируется вплоть до рН 2.

Это привело к формулированию другой схемы, включающей "систему переноса заряда", функционирующую в процессе катализа [31761:

Aspi 02-е;

H1S57.

\)7.......H-N^A......Н-0/

R'-HNC-R

Ser195

0 His57 ,

Aspi02-C^ J GIL \)-h.......R^-h......r'-hnc-e

i

Ser195

Эта схема предусматривает согласованный перенос двух протонов на скорость лимитирующей стадии, что не противоречило данным [31771 по "инвентаризации протонов" (измерение зависимости кинетического изотопного эффекта растворителя в смесях H20/D?0 разного состава; см. разд.3.3.3), указывающих на "мультипротонный" катализ (31781. Однако этот катализ наблюдался и для (Пег-метилгистидин)-химотрипсина, у которого система переноса заряда отсутствует (31791-

В дальнейшем (2350.3180.31811 на примере а-литической протеазы (содержащей только один гистидин) было показано, что рйа His57 около 7. С этим согласуются результаты (2349,31571 исследования низкопольных сигналов ЯМР химотрипсина и других сериновых протеаз, а также результаты [31581 С2-протон-ного резонанса имидазола в трипсине. Анализ структуры протеазы А из Streptomyces griseus показал [3063], что карбоксильная группа Aspi02 связана максимально возможным числом Н-связей (4 связи) и поэтому не может иметь высокого значения рйа-

Кристаллографические данные подвергались неоднократному пересмотру. Ревизия исходных данных [1327] показала (12491, что в нативном а-химотрипсине, а также в 7-химотрипсине, трипсине, субтилизине BPN' и эластазе серино-вый гидроксил не лежит в плоскости имидазольного кольца и О^-атом Sen 95

, о о

отстоит от N -атома His57 на 3,5-3,7 А и отклоняется на 2,5-3,5 А от расположения, необходимого для образования водородной связи (рис.106). Хотя в сериновых протеазах остаток Ser195 может достаточно свободно вращаться вокруг Са-Ср-связи примерно на 120° (см. разд.6.5.3), ни в одном из его положений он не приближается к Ne2-aT0My His57 настолько, чтобы образовать хорошую водородную связь (12291-

Волее поздние результаты показали, однако, что в химотрипсине (12261,

7.2. Системы переноса заряда

309

Рис.106. Стереопара расположения остатков Ser195, His57 и Asp102 в активном центре бычьего а-химотрипсина [1249]

трипсине [12431, калликреине [12431 и протеазе A Streptomyces griseus

о

[3063] это расстояние составляет 2,7-2,9 А.

Наконец, с помощью нейтронографического анализа трипсина и его комплекса с ингибитором, имитирующим тетраэдрическое промежуточное соединение, были получены [31821 прямые доказательства отсутствия переноса протона на Asp102, однако водородная связь между Ser195 и HIs57, по-видимому, существует [3183,3184].

Замена в трипсине остатка Asp102 на Asn [3185] методом направленного мутагенеза приводит к сильному (в «Ю4 раз) падению активности в нейтральной среде. Мутантный фермент почти не отличается по структуре от нативного [2124].

Таким образом, по крайней мере в свободном ферменте и, скорее всего, в фермент-субстратных комплексах "система переноса заряда" отсутствует, а каталитическая "триада" может быть описана схемой:

His57

Aspi02-c;

in-

sert 95

Квантово-химические расчеты [3186-3191] также подтвердили наличие высоких барьеров для переноса протона от Ser195 на His57. С представлением о функционировании Ser195 в неионизированной форме согласуются и данные химической модификации химотрипсина [3152], а также данные по влиянию растворителей на скорость деацилирования ацилхимотрипсинов [3192].

По-видимому, роль Asp102-HIs57 водородной связи заключается в фиксации ориентации имидазольного кольца и распределения в нем электронной плотности, соответствующей выгодному для катализа строению тс-туатомера [2350,31931

310 Глава седьмая. Химическая трансформация субстрата

а также в стабилизации положительного заряда на имидазолий-катионе на последующих стадиях катализа [21891.

У цистеиновых протеаз нет чего-либо подобного "системе переноса заряда". Как уже отмечалось выше (см. также разд.5.2.3), состояние каталитически активных групп в папаине отвечает структуре .ионной пары

ориентация имидазола, по-видимому, стабилизирована водородной связью N -атома с карбонильной группой остатка Asn175 (31221.

Нуклеофильность тиолат-ионов достаточно велика, и они могут эффективно реагировать с карбонильной группой субстрата. Исследования модельных реакций показывают, однако (см. разд.3.4.4), что тиолы довольно инертны в отношении реакций с амидами. Определенные трудности могут возникнуть также при описании последующих стадий катализа.

У аспартатных протеиназ карбоксильные группы остатков Asp32 и Asp215 лежат в одной плоскости и образуют между собой прочную водородную связь. Кроме того, каждый из атомов кислорода карбоксильных групп связан системой Н-связей с другими аминокислотными остатками и молекулами растворителя (см. рис.100). Так, карбоксильная группа Asp32 связана с гидроксильной группой Ser35 и Ш-группой Gly34, a Asp215 - с гидроксилом Тпг218 и NH-группой Gly217. Кроме того, атомы кислорода карбоксильных групп остатков Asp32 и Asp215 расположены на расстоянии, достаточном для образования водородных связей с двумя молекулами воды (3131,31941-

Как уже отмечалось выше, такая симметрия в расположении карбоксильных групп предполагает сходство в значениях их рКа. Однако колоколообразная рН-зависимость катализа этими ферментами и другие факты свидетельствуют о различии в рйа Азр32 и Asp215.

Причина этих различий может быть связана с тем, что отрыв протона, расположенного между этими остатками, приводит к появлению двух близко расположенных отрицательных зарядов, которые из-за системы водородных связей требуют большой энергии для их удаления' одного от другого. Ситуация здесь напоминает ту, что наблюдается у конформационно закрепленных дикарбоновых кислот (2574,3165,31941.

У металлсодержащих протеаз центральную роль в катализе играет ион Zn2+. Этот ион может координировать 4-6 лигандов (31951, включая молекулу воды. Диссоциация координационно связанной воды, очевидно, происходит в области нейтральных рН (см. разд.5.2.3). Если именно эта молекула воды атакует субстрат, то в оптимуме рН функционирования ферментов этой группы концентрация ионов ОН- будет практически равна концентрации фермента. Однако нуклеофильность связанного с металлом иона ОН- (как и его рйа) должна резко сни-

Таким образом, ни у одного из рассмотренных типов амидгидролаз нельзя ожидать высокой нуклеофильности атакующих субстратный карбонил каталитичес-

Cys 25

His 159

н

N

Н

зиться.

7.3. Состояние расщепляемой группы субстрата

311

ких группировок. Эффективность нуклеофильной атаки должна достигаться за счет каких-то других механизмов.

7.3. Состояние расщепляемой группы субстрата

Увеличение реакционной способности гидролизуемой связи по отношению к слабым нуклеофилам возможно, если уменьшить степень резонансной стабилизации этой связи. Это, в свою очередь, должно происходить при выводе амидной связи из копланарности. Возможны два способа нарушения копланарности плоской амидной группы - "пирамидализация" (bending) и "скручивание" (twisting):

Пирамидализации Скручивание

Оба способа ведут к изменению сопряжения свободной пары электронов атома азота и тс-электронов карбонильной группы и различаются тем, что в первом случае карбонильный С-атом выходит из плоскости, образованной атомами О, Cq и N, а во втором - он остается в этой плоскости. Обе эти деформации, если они не очень велики, не требуют значительных энергетических затрат. Даже в случае этилена "скручивание" вокруг двойной связи С-С на 20° сопряжено с затратами около 2,5 ккал/моль (3196).

Проблема резонансной дестабилизации амидной группы в свободных пептидах и фермент-субстратных комплексах уже обсуждалась выше (разд. 1.2.1, 3.3.1 и 6.5.2). Следует еще раз подчеркнуть, что степень пирамидализации зависит от расстояния между нуклеофилом и карбонильным углеродом амида (1469,31971 и, по-видимому, может существенно стабилизироваться вторичными взаимодействиями фермента и субстрата.

Рис.107. Изменение гибридизации в амидной группе при вращении вокруг связи C-N [3136]

Таким образом, можно обоснованно полагать, что в комплексах ферментов с истинными субстратами может происходить заметное нарушение копланарности амидной связи и, следовательно, снижение энергии ее резонансной стабилизации.

"Скручивание" амидной группы должно приводить к изменению гибридизации карбонильного С-атома и атома азота (31361 (рис.107), что делает неравноценными направления присоединения нуклеофила или протона.

7.4. Ковалентный или общий основной катализ?

Каталитически активная- нуклеофильная группа фермента может выступать в качестве ковалентного катализатора, непосредственно атакуя карбонильный атом углерода субстрата:

312

Глава седьмая. Химическая трансформация субстрата

Е-Х"

R

Е-Х-С-0" llHR'

R

Е-Х-С=0 +

I

и т.д.

NH2R'

(1 )

или же в качестве общего основного катализатора, способствуя отщеплению протона от молекулы воды:

R R Е-Х" Н-0 0=0 ==== E-XH-HO-i В NHR'

Е-ХН-НО-С-0" NHR*

Е-Х"

¦R-COOH + NH2R'

и т.д.

;2)

В первом случае образующийся после распада промежуточного тетраэдрического соединения ацильный фрагмент субстрата остается связанным ковалентно с ферментом, тогда как во втором случае такая ковалентная связь отсутствует. Промежуточный ацилфермент в зависимости от соотношения скоростей его образования и распада может накапливаться или не накапливаться в ходе реакции.

Если ацилфермент накапливается в системе, то установить ковалентный тип катализа достаточно просто. Наиболее общий прием заключается в измерении каталитических констант для серии субстратов с одинаковой ацилыюй частью и разными уходящими группами. Действительно, в этом случае (см. разд.4.1.1) реакция идет по трехстадийной схеме:

К

Е + S

ES

ЕА + Рч

Е + Р2,

где ЕА - ацилфермент; &cat=ft2&3/&2+&3 и при &2»&3 *cat=*3- Для всего ряда субстратов величина &cat должна быть одинаковой (1666,17211. Как видно из

Таблица 74. Кинетические константы катализируемого химотрипсином гидролиза производных ациламинокислот [1761 ]

Субстрат* к ., с"1 cat кг, с"1 к3, с

АсТгрОМе 27,7±0,5 730 29

AcTrpOEt 26,9±0,5 700 28

AcTrpONp 30,5±1 ,2 38 300 30,5

AcTrpNH2 0,026 0,026 30

AcPheOMe 57,5 280 72

AcPheOEt 63,5 530 72

AcPheONp 77,0 23 700 77

AcPheNH2 0,039 0,039 72

*ONp - n-нитрофениловый эфир.

7.4. Ковалентный или общий основной катализ

313

данных, приведенных в табл.74, указанное постоянство значений й действительно имеет место для ряда эфиров ациламинокислот - субстратов химотрипсина.

Для различных амидов ациламинокислот величины й сильно различаются, что обусловлено несоблюдением неравенства ft2»ft3-

Этот метод был использован для большого числа сериновых и некоторых цистеиновых протеаз [1766,3198,31993. Следует отметить, что эти исследования не всегда позволяют выявить характер лимитирующей скорость стадии [1427].

Иногда удается детектировать промежуточный ацилфермент с помощью спектральных методов в условиях, когда скорость его распада понижена, например в кислой среде [3200-3205] или в условиях криоэнзимологического эксперимента [2512,3206-32083 (см. также разд.5.7). Однако в этом случае не всегда удается надежным образом отличить ковалентное промежуточное соединение от прочного комплекса фермент-продукт. Были предложены (3205,32093 модификации спектральных методов, существенно повышающие их точность, в том числе и методы флуоресцентного анализа, использованные для идентификации ацилфермента при катализе 6-лактамазой I [3210,32113.

Успешно применяется так называемый метод перехвата, т