йствия фермента (3136,3137 3.

Моделирование структуры комплекса карбоксипептидазы А с пептидом ZAlaAlaTyr (31383, а также анализ структуры комплекса фермента с белковым ингибитором из картофеля (3082 3 позволили идентифицировать вторичные участки связывания в области остатков ArgTl, Туг248 и Phe279.

Изложенные выше результаты вызвали острую дискуссию (см.: (1964, гл.1;

300 Глава шестая. Фермент-субстратные комплексы

31393), особенно в отношении данных по перемещению остатка Туг248. Было показано [1370,31403, что в карбоксипептидазе А, модифицированной арсаниловой кислотой по Туг248, связывание субстрата (в растворе) приводит к переходу метки во внешние слои белковой молекулы, доступные растворителю. Отсюда ставилась под сомнение роль этого остатка в катализе. В конечном счете выяснилось, что этот остаток можно методом направленного мутагенеза (см. разд.4.G.2.) заменить на остаток фенилаланина без заметного изменения активности. По-видимому, спектральные изменения, наблюдавшиеся для арсанил-производных фермента, обусловлены особенностями его кристаллической упаковки (1371,30353. Вместе с тем Туг248 все же участвует в стабилизации комплекса, образуя водородные связи с карбоксильной группой С-концевого остатка субстрата и NH-группой остатка Р .

Обширная дискуссия происходила в отношении числа связывающих субстрат центров у карбоксипептидазы А. Это было вызвано различными спектральными свойствами комплексов фермента с эфирами и амидами (31413. Однако большин-

а

Y248

1

Y248

О

II

НС—ССр,_,--145

¦О'......Arg*

РИС.104. Стереоизображение (а) ингибитора - 2-бензил-4-оксо-5,5,5-трифторпентановой кислоты, моделирующей тетраедричес-кое промежуточное соединение, и схема расположения истинного тетраэдрического промежуточного соединения в активном центре

72

карбоксипептидазы А {б) [3078]

6.5. Структура комплексов

301

ство исследователей разделяют представление о том, что различия в поведении эфиров и амидов обусловлены тем, что карбонил этих субстратов связан соответственно или с ионом Zn2+ или с гуанидиногруппой остатка Arg127. Важное значение может иметь также различие в скорость лимитирующей стадии процесса гидролиза [3677,3142].

Исследование кетоаналогов субстратов [3078,3080], а также фосфонамидатов [2628,3081] в комплексах с карбоксипептидазой позволили составить представление о структуре промежуточных тетраэдрических соединений в ходе катализа. Оба атома кислорода тетраэдра входят в координационную сферу иона Zn2+, а также связываются с остатками Glu270 и Arg127. Схема структуры тетраэдрического промежуточного соединения показана на рис.104.

Несмотря на существенные различия в структуре карбоксипептидазы А и термолизина, ориентация субстратоподобных ингибиторов в активных центрах этих двух ферментов имеет много общего. Изучение структуры комплексов термолизина с р-фенилпропионил-1-фенилаланином, бензилоксикарбонил-Ь-фенилаланином, Ь-бензилянтарной кислотой, фосфоамидоном и другими лигандами [2628,2728, 2891,3083-3087] позволило следующим образом представить строение продуктивного комплекса этого фермента с субстратом (рис.105). Ароматическая боковая цепь остатка Pj субстрата связывается в гидрофобном кармане фермента, образованном остатками Val139, Leu133, Phe130, Leu202, Gly189, Val192 и Ile188. Карбоксильная группа Pj-остатка образует водородную связь с гуанидиногруппой Arg203, a NH- и СО-группы остатка Р? субстрата - водородные связи с амидной группой боковой цепи остатка Asp112. Остаток Р? связывается с основной цепью остатка Тгр115, образуя с ним участок р-структуры. Расщепляемая связь субстрата локализуется вблизи иона Zn2+ и его карбонильная группа занимает положение четвертого лиганда атома металла. Карбоксильная группа

о

Glu143 оказывается на расстоянии около 4 А от карбонильного атома углерода, причем рядом с карбоксилом расположена молекула воды. Наконец, Иег-атом остатка His231 оказывается вблизи NH-группы Pj-остатка субстрата. Конформационные изменения, детектируемые при связывании фосфоамидона, ограничиваются

о

несколькими десятыми долями А и затрагивают боковые цепи остатков Asn112,

Рис.105. Связывание субстрата в активном центре термолизина [3085]

302

Глава шестая. Фермент-субстратные комплексы

Leu202 и Glu.143.

Непосредственное окружение иона Zn2+ в термолизине и карбоксипептидазе А очень сходно [1348,2628]. Более того, такое же окружение наблюдается у некоторых дегидрогеназ.

Важным обстоятельством является то, что в ближайшее окружение атома металла входят как карбонильная группа субстрата, так и молекула воды, т.е. цинк находится, по-видимому, в пентакоординационном состоянии.

6.6. Оценка полной энергии фермент-субстратного взаимодействия

Интересно -оценить полную энергию взаимодействий субстрата и фермента и сравнить ее с наблюдаемыми величинами. Дать такую оценку можно лишь весьма приближенно. Из данных по структуре комплекса AcProAlaProTyrOH в активном центре протеазы А из Streptomyces griseus известно (зобз), что этот тетра-

о

пептид образует с ферментом 78 Вангдер-ваальсовых контактов с г<4 А и 7 водородных связей. Принимая- среднюю величину энергии Ван-дер-ваальсова контакта в -0,05 ккал/моль и энергию водородной связи порядка -3 ккал/моль (см.табл.66), получаем полную энергию взаимодействия порядка -25 ккал/моль. Оценки энергии взаимодействия Р^остатка в карбоксипептидазе А (3143) дали значение -15 ккал/моль. Полная энергия невалентных взаимодействий в ацил-ферменте - индолилакрилоилхимотрипсине (3024) составляет около -30 ккал на моль. Электростатическое взаимодействие карбоксилат-иона и гуанидиногруппы в карбоксипептидазе дает вклад около -11 ккал/моль (3135). Наконец, Ван-дер-ваальсовы взаимодействия в подцентре D активного центра лизоцима с гли-копиранозидным циклом составляют -14 ккал/моль (2939).

Для всех перечисленных соединений константы равновесия комплексообразования составляют около 1.10_3-1 -10~4 М, что соответствует изменению свободной энергии 4,2-5,5 ккал/моль. Величина энтальпии комплексообразования, например ацетилтриптофана с химотрипсином, составляет -9 ккал/моль (2469). Таким образом, наблюдаемая энергия комплексообразования, по-видимому, намного ниже, чем та энергия, которая получается расчетным путем при суммировании всех взаимодействий белка и лиганда.

Очевидно, что при расчетах не принимаются во внимание затраты энергии на конформационные изменения белка и субстрата и многие другие факторы, трудно поддающиеся учету. Эти затраты, по-видимому, важны для катализа.

6.7. Заключение

Изложенные выше сведения позволяют отметить следующие важные характеристики фермент-субстратных взаимодействий: а) связывание фермента с субстратом во многих случаях происходит ступенчато, причем за быстрой диффузионно-контро-лируемой стадией ассоциации следует более медленная стадия "подстройки" реагирующих веществ; б) в продуктивном фермент-субстратном комплексе возможно искажение структуры планарной амидной связи, претерпевающей гидролиз, так что она становится неплоской ("пирамида'лизация"); 6) образование комплекса,

6.7. Заключение

303

как правило, сопровождается конформационными перестройками белка; эти перестройки обычно носят локальный характер; г) фермент-субстратный комплекс стабилизируется многими нековалентными связями; общая энергия этих связей превышает величину свободной энергии, измеряемую на основании, величин констант ассоциации фермента и субстрата.,

Глава седьмая

ХИМИЧЕСКАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ СУБСТРАТА

Образование продуктивного фермент-субстратного комплекса создает возможность для реализации следующего этапа каталитического акта - химического превращения субстрата в' продукты реакции. Эффективность такого превращения будет определяться состоянием каталитических групп фермента в комплексе, их расположением относительно гидролизуемой связи и состоянием самой расщепляемой связи субстрата. Отдельные вопросы, касающиеся механизмов этой стадии каталитического акта, освещены в обзорах [9,1405,1406,1613,3144-31493.

7.1. Состояние каталитически активных групп

Эффективный гидролиз амидов и других производных карбоновых кислот требует наличия в системе трех компонентов: нуклеофила, непосредственно атакующего карбонильный углерод гидролизуемого соединения; общего (или специфического) основного катализатора, способствующего отщеплению протона от молекулы воды или другого нуклеофила, и общего кислотного катализатора, стабилизирующего промежуточные структуры и способствующего отщеплению уходящей группы. Очевидно, что роль нуклеофила и общего основного катализатора могут играть группы, несущие отрицательный заряд или имеющие избыточную электронную плотность, тогда как в роли общих кислотных катализаторов могут выступать группы электрофильного характера, несущие легкодиссоциирующий протон.

Участвующие в катализе группы у представителей всех типов амидгидролаз в настоящее время довольно однозначно идентифицированы (см. разд.2.6). Однако их состояние и конкретная роль в катализе во многих случаях остаются предметом дискуссий.

У сериновых протеаз важнейшими каталитически активными грушами являются гидроксильная группа остатка Ser195 (по нумерации химотрипсина), имидазоль-ная группа остатка His57 и карбоксильная группа остатка Asp102. Кроме того, существенную роль в катализе играют амидные группы основной цепи белка -Ш-группа Ser195 и NH-группа Gly193.

У цистеиновых ферментов эквивалентами первых двух групп служат SH-rpynna остатка Cys25 (нумерация папаина) и имидазольная группа His159. Группа, аналогичная Азр102 у цистеиновых протеаз, по-видимому, отсутствует, однако возможно участие в катализе карбоксильной группы остатка Asp158 [3150]. Аналогами двух других групп являются группа боковой цепи Gln19 и NH-rpyima основной цепи Cys25.

Аспартатные протеазы содержат две каталитически активные группы Азр32 и Asp215 (нумерация пепсина).

Металлзависимые экзопептидазы (карбоксипептидазы) содержат в активном центре ион Zn2+, и, кроме того, в катализе участвуют группы Glu270 и Arg127 (нумерация карбоксипептидазы А быка). У эндопептидаз этого типа наряду с Zn2+ имеется карбоксил остатка Glu143 и вместо аргининового остатка - остаток His231 (нумерация термолизина).

7.1. Состояние каталитически активных групп

305

Кроме этих групп в активных центрах многих амидгидролаз методами кристаллографического анализа высокого разрешения обнаруживают связанные молекулы воды.

Таким образом, в качестве каталитически активных групп выступают остатки, весьма сильно отличающиеся по значениям рйа и, следовательно, по способности к ионизации в области рН, оптимальной для действия фермента.

Состояние ионизации каталитически активных групп зависит от конкретного их окружения в молекуле белка. Результаты исследования рН-зависимости катализа (см. разд.5.2), химической модификации (2344,2359,3151-31563, физико-химических исследований (2345,2347,2349,2350,2355,3157-3162] и теоретических расчетов (3163-3165] позволили достаточно надежно определить значение рйа каталитически активных групп во многих амидгидролазах (табл.73).

Данные табл.73 нуждаются в некоторых коментариях. Основность серинового гидроксила в ферментах группы химотрипсина, трипсина и др. определить не

Таблица 73. Значение рйа и состояние ионизации каталитически активных групп некоторых амидгидролаз

Группа Фермент РНопт Доля -заряженной формы в рН„„т * опт Литературный источник

-CH?OH Химотрипсин и др. >«13,5 8,0 3,2-Ю"6 [1527]

-CH?SH Папаин 4,1* 6,0 0,99 [2345]

Химспапаин А 6,8 7,2 0,71 [3153]

и—1 Химотрипсин 6,8 8,0 0,06 [3160]

Трипсин свиньи а-Литическая протеаза 5,0 5,7 8,0 8,0 1 -10"3 5-Ю"3 [3160] [3160]

Папаин 4,2Ь* 6,0 2-10~2 [3169]

Термолизин 7,8 8,0 0,39 [1527,2329]

-СООН а-Литическая протеаза (Авр102) 4,5 8,0 1 [2350 J

Папаин (Авр158) 4,2 6,0 •0,98 [3150]

Пепсин (Asp32) 1,5 2,5 0,91 [2324,3170]

(Авр215) 4,7 2,5 6,3-1 о-3 [2324,3170]

Карбоксипептидаза A (Glu270) 6,0 8,0 0,99 [3171 ]

Термолизин (Glu166) 6,2 8,0 0,98 [1527]

Zn2t..онг Карбоксипептидаза А «7 8,0 0,9 [1566]

Термолизин *>7 8,0 0,9 [1566]

CONH Все ферменты «18** - [71 ]

*3начения рК каталитических групп папаина сильно зависят от рН и состояния SH-группы.

**Для ионизации CONH ^==> CON" + Н+.

20. В.К. Антонов

зоб Глава седьмая. Химическая трансформация субстрата

удается, поскольку титровать белки до значений рН«14 невозможно. Указанное в таблице значение рйа приписывается этому остатку на основании значений рйа гидроксильной группы в N-ацетилсериламиде. Одно время полагали [3166], что значение рйа серинового гидроксила может быть значительно меньше (<«8) за счет соседства с положительно заряженными группами, например аргинина. Однако кристаллографические данные не подтвердили это предположение.

Довольно сложным является состояние ионизации остатков Cys25 и His159 в папаине и некоторых других родственных цистеиновых ферментах. Значение рКа каждой из этих групп зависит от состояния ионизации другой группы. Предполагается, что в папаине существует следующая система прототропных равнове-

СИЙ: К^ Im—Е SH ^К,2

ImH—Е—SH Im—Е—S"

ImH—Е—S

с рК1 4,26; рЯ2 3,34; рй1? 7,55 и р#21 8,47. Это, по-видимому, обусловлено существованием двух рН-зависимых конформационных состояний фермента (см. разд.5.2.3.) и, вероятно, является следствием влияния электростатического поля, создаваемого группой с рйа 5-6, удаленной от каталитического центра [3167]. У папаина ионизация этой группы практически не сказывается на активности, но у катепсинов В и Н и у актинидина это влияние достаточно велико. В актинидине предполагается (3167), что такой группой является карбоксильная группа остатка Glu52.

Экспериментально определяемые константы ионизации связаны с приведенными здесь микроскопическими константами соотношениями [3168):

K12K21

К1 = K.+IL и К' = -.

Для многих групп в ферментах значения рйа приписаны лишь на основе данных по рН-зависимости кинетических констант гидролитических реакций, о сложности таких отнесений уже говорилось с разд.5.2.2.

Значения рйа карбоксильным группам Asp32 и Asp215 (соответственно 1,5 и 4,7) были приписаны на основании рН-зависимости их химической модификации эпоксидами и диазосоединениями (1343,2693), а также рН-зависимости пепсинового катализа. Реакции химической модификации - довольно сложные процессы, и нет полной уверенности в том, что эти данные однозначно характеризуют состояние ионизации исследуемых групп. Более того, учитывая удивительную симметрию расположения и взаимодействий карбоксильных групп активных центров этих ферментов (см. разд.6.5.3) можно предположить близость их рйа, а ионная асимметрия может возникать лишь в комплексе с субстратом. Хотя кван-тово-химический анализ (3165) в целом согласуется с этими представлениями, не исключено, что приписывание значений рКа эт