химический каталог




Химия протеолиза

Автор В.К.Антонов

мальным для образования водородных связей у этих производных фермента.

294

Глава шестая. Фермент-субстратные комплексы

Имеющиеся данные не позволяют оценить расстояние между карбонильным С-

атомом истинного субстрата и атомом серы, а также между N°1-атомом His159 и

уходящей группой. В свободном ферменте расстояние Ns1 His^-S^ Cys25 cocci

тавляет 3,4 А И48], что достаточно для образования водородной связи между ними.

Очень сходным образом связываются с папаином эпоксидные ингибиторы E-G4 и E-G4c [2735,3069 3. Эти соединения образуют ковалентные связи с атомом серы Cys25, который атакует С2-атом эпоксидного цикла, причем наблюдается инверсия конфигурации этого'атома. Карбоксильная группа ингибитора образует Н-связи с амидной группой Gln19 и NH основной , цепи Cys25, а также в случае Е-64с Ne2 атомом остатка His159.

Остаток Р3 хлорметилкетонов, а также концевая изопропильная (у Е-64с) и концевая гуани,диногруппа (у E-G4) связываются вблизи боковой цепи Туг67, и остаток Ala в этом положении находится в контакте с фенольным кольцом Туг61 и Са-атомом Gly65.

Связывание ингибиторов папаином приводит к довольно значительным конфор-мационным изменениям в белке. В случае хлоркетонов атом серы Cys25 сдвига-

о

ется на 0,9 А в глубь белковой глобулы, что сопровождается перемещением атомов основной цепи остатков Ser24 и Gly43. При этом боковая цепь Ser176 поворачивается вокруг связи Са-С^ на «120° так, что ее гидроксильная группа располагается на расстоянии водородной связи от 0е1 Gln19.

В свободном ферменте протонированная имидазольная группа His159 и ионизированный атом серы Cys25 лежат в одной плоскости, причем Ые2-атом Hisl59 оказывается далеко от предполагаемого места локализации N-атома уходящей группы истинных субстратов, однако имидазольное кольцо при связывании субстрата может повернуться на <«30° и занять положение, необходимое для передачи протона. Такой поворот не сопровождается разрывом Н-связи Ne2 Hls159 и СО Asn175.

Связывание ингибиторов приводит и к другим перестройкам основной цепи в области Arg59-Pro68, Ser21-Gly23 и :Lys156-His159, доходящим по амплитуде до

о

1 А. Эти конформационные изменения открывают доступ субстрата или ингибитора в область активного центра фермента. По данным исследования моделей комплекса папаина с субстратом [31233 уходящая группа субстрата в таком комплексе может неблагоприятным образом взаимодействовать с а-СН2-группой His159, однако это взаимодействие не реализуется в тетраэдрическом промежуточном соединении. Неблагоприятное взаимодействие тем сильнее, чем больше размер боковой цепи остатка Pg, что может объяснить факт зависимости величины &cat (а не Кт) от гидрофобности этого остатка в субстратах.

Исследование модели, а также данные низкого разрешения (G А) для комплексов папаина с кваэисубстратами AlaAlaPhe(I-n)Arg и BocPhe(I-n)Arg [3124З позволяют идентифицировать участок связывания уходящей группы в районе остатков Тгр177 и А1а13б [18023. Следует отметить, что область остатка Тгр177, по-видимому, соответствует той, где происходит непродуктивное связывание некоторых субстратов типа п-нитроанилидов ациламинокислот. Такой вывод был сделан на том основании, что модификация этого остатка увеличивает активность папаина к подобным субстратам [31253.

6.5. Структура комплексов

295

Построение модели взаимодействия цистатина с папаином 12797] выявило высокую комплементарность области активного центра фермента и "реактивного" центра ингибитора. Этот центр (см. также разд.5) включает остаток Gly9 ингибитора, который в комплексе должен располагаться вблизи Cys25, и консервативный участок 53-57, погружающийся в "щель" между остатками Cys25 и Тгр177, причем остатки ингибитора Leu54 и Val55 контактируют с гидрофобными участками А1а136, А1а137 и Gly23 папаина. Участок Рго103-Тгр104 ингибитора также взаимодействует с ферментом в области Тгр177, причем оба триптофана находятся в стекинг-взаимодействии.

Папаин - пока единственная цистеиновая амидгидролаза, для которой имеются кристалографичесие данные о структуре фермент-ингибиторных соединений и комплексов. Анализ кристаллографических данных другой цистеиновой протеазы актинидина в свободном состоянии показывает значительное сходство структуры активного центра со структурой папаина, хотя имеются и некоторые существенные отличия (1264,12653. Так, атом серы каталитически активного остатка

о

цистеина в актинидине отдален на 2,7 А от плоскости имидазольного цикла и при такой ориентации не может образовывать Н-связь с атомом NC1 последнего. Однако, как и в папаине, имидазольное кольцо может поворачиваться на 35° так, что атом серы оказывается в одной плоскости с имидазольным циклом. Такое положение имидазола стабилизируется тем, что он оказывается в плоскости, параллельной плоскости индольного цикла Тгр177. Папаин существует в растворе в двух формах, отличающихся ориентацией имидазольного цикла по отношению к остаткам Asn175 и Asp158 (формы "вверх" и "вниз") (23433. В то же время фицин, по-видимому, существует только в одной конформации ("вверх"). Вероятно, и актинидин относится в этом отношении к типу фицина, а не папаина.

Различия в каталитических свойствах актинидина и папаина трактовались также (31263 как следствие различий в распределении электростатического поля в активном центре ферментов, однако такая трактовка встретила возражение [3127З. Заметные отличия в свойствах от папаина наблюдаются также для бро-мелаина. Изучение резонансных Раман-спектров дитиоацилферментов показало [3092], что субстрат в активном центре бромелаина имеет конформацию, отличную от таковой в папаине.

Аспартатные протеазы. Для комплекса свиного пепсина с дипептидом - метиловым эфиром фенилаланилдийодтирозина имеются рентнгеноструктурные данные

о

лишь при разрешении 3 А (3070,31283. Однако для очень сходных микробных аспартатных протеаз наряду с результатами относительно низкого разрешения

о

(2,8-3,7 А) [1281,1345,31293 опубликованы сведения, позволяющие достаточно подробно описать связывание субстрата в активном центре этих ферментов [2612,3071-3073,3076 3.

Активный центр аспартатных протеаз, как и в случае папаша, расположен в "щели", образуемой двумя доменами белковой молекулы. Каталитически активные группы Asp32 и Asp215 входят в состав разных доменов, но в пространст-

о

венной структуре сближены на расстояние «2,6 А (между атомами кислорода). Эти группы находятся в глубине "щели".

Связывание субстратоподобных ингибиторов можно проследить на примере

296 Глава шестая. Фермент-субстратные комплексы

РИС.100. Стереоизображение участка активного центра пенициллопепсина, связанного с тетрапептидом AlaLysPhe(N0 )А1а (выделено жирной линией) [3129]

комплекса, восстановленного по расщепляемой связи гептапептида -D-HisProPheHisPheCHgNHPheValTyrOH с ризопуспепсином (3076), а также близкого по структуре пептида (Н256) - ProThrGluPheCHgNHPheArgGluOH с эндотиапеп-сином (2612). Эти ингибиторы встраиваются в активный центр в вытянутой конформации (рис.100) так, что атом углерода, имитирующий карбонильную группу субстрата располагается вблизи каталитически активных остатков Asp32 и Asp215 (нумерация пепсина). Группа МН остатка Phe в положении Р^ находится ° я?

на расстоянии 2,83 А от О -атома Asp215 [3076]. Ориентация карбоксильной группы расщепляемой связи может быть выведена из анализа структуры комплексов аспартатных протеаз с пепстатином и его аналогами (3071,3072,3075), пептидами типа R-OKOHJCHgCOR' (где R и R* - остатки аминокислот) (3073,

РИС.101. Расстояния между атомами кислорода карбоксильных групп активных центров аспартатных протеаз (нумерация ри-зопуспепсина) и молекулой воды

Цифры (сверху вниз) для ендотиапепсина, пенициллопепсина и ризопуспепсина [3076]

3130] и из модельных построений [2334,3131]. В свободных ферментах группы Asp32 и Asp215 образуют удивительно симметричную структуру (рис.101). Карбонильная группа субстрата распологается, по-видимому, так, что молекула воды, связанная с четырьмя атомами кислорода Asp32 и Asp215, вытесняется карбонильным атомом кислорода субстрата [3131). Боковая цепь остатка Р

6.5. Структура комплексов

297

взаимодействует с группой гидрофобных остатков в ферменте - ПеЗО, Тут75, РпеШ и 11е120. Группа NH этого остатка образует Н-связь с карбонильной группой.Gly217. Как уже отмечалось в гл.4, аспартатные протеазы можно разделить на две группы по специфичности к Р -остатку - группу пепсина, куда входят пепсины из разных источников, химозин, ренин и др., специфичные к ароматическим и объемным гидрофобным остаткам в этом положении, и группу пенициллопепсина (эндотиапепсин, ризопуспепсин и др.), обладающую выраженной лизиновой специфичностью [23343.

Важное отличие этих двух групп ферментов - остаток Asp114, характерный для всех изученных ферментов, способных гидролизовать субстраты, содержащие в Р1 остаток лизина. e-NHg-rpyima лизина таких субстратов располагается вблизи остатка AspH4 и взаимодействует с ним, давая, по-видимому, Н-связь через мостиковую молекулу воды [23343. Следует отметить, что пепсин также имеет катионсвязывающий центр, расположенный в области вторичных фермент-субстратных взаимодействий как в S-, так и в S'-областях [30053.

Модельные построения и данные рентгеноструктурного анализа дают зоны вторичных взаимодействий для "идеального" (по данным индексов специфичности, см. разд.4.3.2.1) субстрата пепсина, приведенные в табл.72 [12703.

Таблица 72. Остатки пепсина, контактирующие с боковыми цепями "идеального" субстрата HAsnlleGluPheTyrValLeuOH

Субстрат Остатки пепсина рд Абп Б4 Thr12, Бег219, Leu220, (Glu244, Met245)

рз Не Бз Glu13, ПеЗО, Phem, Рпе117, Бег219

рг Glu Бг Thr218, ТПГ222, Glu287, Met289, Gly76, Thr77

р1 Phe Б1 ПеЗО, Авр32, Tyr75, Thr77, Phe111, Leu112, Phe117, Ile120,Gly217

р; Туг б; Tyr189, (Gln191), Ile213, Val291 , Thr293, Leu298, ПеЗОО

Ч Val Бг Gly34, Бег35, Авп37, Пе73, Туг75, Ala130

рз Leu Бз Ile128, Gly188, Tyr189

Группы NH и Co субстрата в положениях Рг, Р^, и Рг образуют водородные связи с соответствующими патрнерами основной цепи фермента и карбоксильными группами остатков аспаргиновой кислоты. N-концевой фрагмент пептидного субстрата, по-видимому, более подвижен в комплексе, чем С-концевой фрагмент, о чем свидетельствуют ЭПР-спектры соответственно меченных спин-метками аналогов пепстатина [3132 3. Что касается конформационных перестроек самих ферментов при связывании субстратоподобных ингибиторов, то этот процесс не сопровождается значительными изменениями в области активных центров. Однако, как это было отмечено, для пепсина [1270З и для эндотиапепсина (30733 происходит хотя и небольшое, но важное изменение взаимного расположения двух доменов - N- и С-концевых. С-концевой домен (остатки 193-298) поворачивается целиком (как "твердое тело") на «4° и смещается на 0,3 А вдоль оси, проходящей через С^-атомы остатков Asp32 и Asp215. Это приводит к заметному изменению конфигурации всей "щели" активного центра - расстояние

298

Глава шестая. Фермент-субстратные комплексы

между некоторыми остатками изменяется на величину до 2 А. Предполагается [30733, что эти изменения важны для механизма действия (см. гл.7). Боковые

о

цепи некоторых остатков смещаются на расстояние до 2,5-3,5 А.

На основе вышеприведенных экспериментальных данных была построена модель комплексов аспартатных протеаз с субстратом в переходном состоянии (или,

Туг 75

Рис.102. Структура тетраэдрического промежуточного соединения в активном центре аспартатных протеаз

ОН и ОТ - атомы кислорода расщепляемой группы субстрата Пунктирные линии - водородные связи. Показано взаимодействие одного из атомов кислорода (ОТ) с ароматическим циклом Туг75 [3130]

скорее, в виде тетраэдрического промежуточного соединения) (3130] (рис. 102). Обращает на себя внимание постулированное в этом комплексе-взаимодействие одного из атомов кислорода тетраэдра с ароматическим циклом остатка Туг75, которое может давать вклад в энергию связывания до 5 ккал/моль [3133].

Метсилозабисшше протеазы. Известна структура комплексов карбоксипептидазы А с рядом субстратоподобных ингибиторов и структура фермент-ингибитор-ных комплексов термолизина (см. табл.69). Наиболее подробно был изучен комплекс карбоксипептидазы А с GlyTyr. Предполагалось, что связывание этого дипептида ферментом отражает продуктивное связывание истинного субстрата, однако дальнейшие исследования (3079] показали, что субстрат вытесняет воду из координационной сферы иона Zn2+, т.е. связывается непродуктивно. Вместе с тем исследование этого комплекса дало очень много для понимания структуры и механизма действия карбоксипептидазы А.

Глицилтирозин связывается ферментом вблизи атома цинка так, что ароматическая боковая цепь лиганда помещается в "гидрофобный карман", образованный боковыми цепями остатков 11е243, 11е247, Туг248, Gly253, 11е255, ТПГ268. Боковая цепь остатка Туг248 располагается в плоскости почти перпендикулярной плоскости тирозинового кольца субстрата (рис.103).

Карбоксилат-ион субстрата образует солевую связь с гуаьшдиногруппой остатка Arg145, а карбонильная группа амидной связи координирует с ионом Zn2+. В истинных субстратах эта группа, по-видимому, направлена в сторону гуаьшдиногруппы остатка Arg127 (30811. Заряженная аминогруппа при высоких значениях рН (в непротонированной форме) дает координационную связь с ионом Zn2+ [3134], что приводит к вытеснению воды.

Все эти взаимодействия сопровождаются значительными конформационными пе-рэстройками в активном центре фермента: а) гуанидиновая группа Arg145 пере-

о

метется на 2 А в направлении к лиганду за счет поворота вокруг связи С -

6.5. Структура комплексов 299

РИС.103. Стереоизображение псевдосубстрата глицилтирозина в активном центре карбоксипептидазы А [ 149]

о

С ; б) карбоксильная группа Glu270 также смещается на 2 А и занимает поло-

1 о

жение, в котором один из атомов кислорода отстоит на 3,6 А от карбонильного углерода субстрата; в) наиболее значительным является изменение ориентации

о

боковой цепи Туг248. Фенольный гидроксил этого остатка перемещается на 12 А

о

за счет вращения вокруг С -С.-связи и небольшого (1-2 А) смещения полилеп-

а р о

тидной цепи. В новом положении фенольный гидроксил Туг248 отстоит на 3 А от NH-группы расщепляемой связи. Перемещение Туг248 становится возможным в результате смещения Arg145 при образовании этим остатком солевой связи с карбоксилат-ионом субстрата.

Квантово-химические расчеты (31353 показывают, что энергетически более выгодным является механизм "скольжения" субстрата в направлении Arg145, так что карбоксилат-ион попеременно образует солевые связи с остатками Arg71, Arg127 и, наконец, Arg145.

На основании анализа моделей было сделано заключение, что при связывании субстрата в активном центре карбоксипептидазы А возможно существенное искажение плоской структуры амидной связи. Этому обстоятельству придается большое значение при формулировании механизма де

страница 46
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Химия протеолиза" (8.49Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
подобрать проектор
мобильные выставочные стенды
дверные ручки sicma
обучение монтажу вентиляции

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(21.10.2017)