химический каталог




Химия протеолиза

Автор В.К.Антонов

а другом и с пептидной связью (1431.

сн, S н п ?Нг н

о о

6

СНз й и И Н

Д L„ Н н П СНз

о^сн2 о

288

Глава шестая. Фермент-субстратные комплексы

Таблица 71. Внеплоскостная деформация амидной связи в комплексах некоторых амидгидролаз и их зимогенов (обозначения углов см. на стр.10)

Комплекс Связь ш1 "с г С'-О'ЧБеП 95) Литературный источник

Трипсин - BPTI Ъув15-А1а16 163,9 -12,9 2,7 [3043]

Трипсиноген - SPTI Lys15-Ilel6 172,8 -14,5 - [3095]

Трипсиноген - Lys15-А1а16 165,6 -10,4 2,8 [3096]

- BPTI(Arg15) - IleVa

Трипсиноген - BPTI » 162,8 -18,5 2,9 [3045]

Ангидротрипсин - BPTI it 159,5 -10,3 - [3045]

Субтилизин Карлсберг -- эглин С Leu45-Asp46 158,0 И0,1 2,81 [3056]

Лейкоцитарная эластаза - ОМТ-3 Leu18-Glul 9 172,0 -5 2,6 [3052]

му, следствием деформации связи в комплексе. Качественные данные о наличии подобной деформации имеются и для других фермент-квазисубстратных комплексов (3049,3054,3057,3087].

Эти данные дают основание полагать, что активные центры, по крайней мере ряда протеаз, "настроены" на деформированную в направлении тетраэдрического состояния амидную группу субстрата. Подтверждением этому могут служить многочисленные данные о связывании кетоаналогов субстратов и пептидальдегидов в виде тетраэдрических гемиацеталей и гемитиоацеталей (кеталей) [3045,3051, 3060-3062,3068,3078,3080,3099]¦

Эта дисторсия, по-видимому сохраняется и в ацилферментах, о чем говорят данные резонансных Раман-спектров хромогенных ацилхимотрипсинов (3100, ЗЮ1 ].

Следует отметить, что не во всех комплексах белковых ингибиторов с протеазами наблюдаются отклонения амидной группы "реакционного центра" от пла-нарности (3042,3067]. Более того, в некоторых ацилферментах, например в ацилпапаинах, наблюдается увеличение двоесвязанности расщепляемой одинарной C-S-связи (3093,31021.

Хотя степень дисторсии амидной связи в кристаллах комплексов амидгидролаз с субстратоподоОными ингибиторами зависит от метода уточнения кристаллографических параметров (30661, сам факт такой дисторсии, по-видимому, не вызывает сомнения. Это обстоятельство может иметь важное значение для понимания эффективности и специфичности амидгидролаз [1715,3103,31041 (подробнее см. гл.8).. Дисторсионный механизм катализа, по-видимому, наблюдается также у пептидилпролин цис-транс-изомеразы [31051.

6.5.3. Расположение на ферменте и взаимодействия

В этом разделе мы детально рассмотрим, как располагаются субстратоподобные соединения в активных центрах некоторых ферментов, судя по данным рентгено-структурного анализа.

Сериновые протеазы. Имеются довольно подробные данные о структуре комплексов сериновых протеаз с квазисубстратами, продуктами гидролиза и ингиби-

6.5. Структура комплексов

289

РИС.96. Стереопара расположения AoProAlaProTyrOH в активном центре протеазы А из Streptomyces grleeue [3063]

торами (см. табл.69). Взаимодействие ароматического кольца субстрата в положении Р впервые было описано в работе (1329) на примере комплекса химотрипсина с формил-Ь-триптофаном, а вторичные взаимодействия - на примере комплексов трипсина с панкреатическим трипсиновым ингибитором (3043,3044] и комплексов протеазы А из Streptomyces griseus с тетрапептидами типа AcProAlaProTyrOH [3063] (рис.96).

Участок связывания боковой цепи остатка Р1 (S1-участок) у химотрипсина ограничен "снизу" цепью остатков 213-220, а "сверху" остатками 190-192. В глубине этого "гидрофобного кармана" расположена боковая цепь остатка Sen89, а снаружи - боковая цепь остатка Met192.

Ароматическая группа квазисубстратов химотрипсина погружена в этот гидрофобный карман так, что ее плоскость параллельна плоскости амидных связей Ser190-Cys191 и Trp215-Gly216. Ср-атом субстрата по данным ЯМР (31061, по-видимому, контактирует с растворителем.

В трипсине остатки Lys или Arg субстрата расположены аналогичным образом, однако существенным отличием трипсиноподоОных ферментов от ферментов химотрипсиновой группы является наличие в первых остатка Asp189 (вместо Sen 89). Заряженные группы субстрата образуют с карбоксилат-ионом этого остатка солевую связь (12351.

Отличие S1-участка субтилизинов от соответствующего участка в химотрип-сине заключается в том, что он значительно более открыт и доступен растворителю, так что связывающаяся в этом участке ароматическая группа одной своей стороной экспонирована в растворитель (30601. То же самое наблюдается в комплексах субтилизинов с макромолекулярными ингибиторами, где боковые цепи гидрофобных остатков (Рго42, Leu45, Leu4T в эглине С) частично контактируют с растворителем [3056,31071. Наконец, в случае панкреатической эластазы [ЗЮ81 в положениях 216 и 226 вместо остатков Gly (у химотрипсина и трипсина) имеются соответственно остатки Val и Thr (Asp в лейкоцитарной эластазе). Наличие этих остатков препятствует связыванию объемистых группировок и играет определяющую роль в специфичности эластазы к боковым цепям

19. В.К. Антонов

290

Глава шестая. Фермент-субстратные комплексы

остатка Ala в Р1.

Расположение ароматической группы в локусе S1 протеазы А практически идентично расположению триптофанового остатка в химотрипсине [30631.

Остаток тирозина в комплексе протеаза А - продукт (AcProAlaProTyrOH) образует несколько водородных связей (рис.96).

Это, во-первых, водородная связь с карбонильной группой остатка Ser214

о

(3,03 А). Важность этой связи для катализа постулировалась неоднократно, однако ее не удалось обнаружить в комплексе формилтриптофана с химотрипсином [13291 и в комплексах с трипсином [12311. Она также не выявляется при расчете конформации субстратов в активном центре фермента методом атом-атомных потенциалов [3024]. Однако эта связь обнаруживается в алкилирован-ных пептидными хлорметилкетонами сериновых протеазах, а также в комплексах этих ферментов с белковыми ингибиторами (3040,3043,30611.

Три водородных связи образует карбоксильная группа остатка тирозина:

а) с протонированным Ые2-атомом HlsST (2,82 А); б) с NH пептидной группы

о о

остатка Gly193 (2,81 А) и 6) слабую связь («в, 2 А) с НН-группой Sen95.

Первая связь имитирует перенос протона на уходящую группу в субстрате, а вторая и третья, характерные для карбонильных групп субстратов и ацилфер-ментов, составляют участок связывания, называемый "оксианионной полостью" [1328,3060).

Водородные связи с Ш-группами остатков Glyl93 и Sen 95 наблюдаются практически во всех комплексах сериновых протеиназ с белковыми субстратопо-добными ингибиторами [3021,3044,3049,3066,ЗЮ91 - Как уже отмечалось выше, во многих из этих комплексов амидная группа "реакционного центра" пирамида-лизована. Это приводит к тому, что расстояние между От-атомом Sen95 и карбонильным углеродом потенциально расщепляемой связи снижено по сравнению с

о

суммой Ван-дер-ваальсовых радиусов до 2,6-2,9 А, но больше, чем длина кова-лентной связи. Примерно на таком же расстоянии расположен От-атом Sen95 от Ые2-атома Hls57.

остатки лиганда Р2-Р4 образуют антипараллельную р-складчатую структуру с цепью фермента 214-218, причем остаток Gly216 своими NH- и СО-группами связывается с группами СО и Ш остатка в положении Р3- Такое взаимодействие наблюдалось с пептидными хлорметилкетонами и белковыми ингибиторами у а- и 7-химотрипсина, эластазы, субтилизина, протеазы В из Streptomyces griseu3 и трипсина [1242,1330,3044,3046,3061,30651. В трипсине, однако, из-за делеции в положении 218 СО-группа Gly216 ориентирована так, что не может акцептировать водородную связь с субстратом, хотя NH Gly216 сохраняет способность акцептировать Н-связь с Р3-остатком.

Квазисубстрат образует множество гидрофобных контактов в активном центре фермента. В комплексе AcProAlaProTyrOH с протеазой А больше половины (44 контакта) приходится на остаток Туг в положении Р , взаимодействующий с остатками А1а192, Gln192A, РГ0192В, Gly215, Gly216 и Thr226. Мндольное кольцо в комплексе ForTrpOH с химотрипсином образует 41 контакт с ферментом. Остаток Pro (Р2) образует 12 контактов с остатками Hls57, Туг171 и Ser214 и, как уже отмечалось, с карбонильным кислородом Ser214. Остаток Ala (Р3) не взаимодействует с ферментом, за исключением упоминавшихся выше двух во-

6.5. Структура комплексов.

291

дородных связей, а остаток Pro (Рд) дает 12 контактов с остатками VaH69, Asn170, Туг1-71 и Gly216. Дальнейшее увеличение пептидной цепи субстрата приводит к выходу дополнительных остатков в раствор и не сказывается на скорости его расщепления [31101.

Рис.97. Взаимодействия аминокислотных остатков бычьего панкреатического ингибитора (показана связь LyBl5-Ala16) с группами активного центра химотрипсина [2011]

Положение остатка в уходящей группе субстрата (Р^) было проанализировано на основании данных о структуре комплексов панкреатического три-псинового ингибитора с трипсином и химотрипсином (рис.97). Остаток А1а16 в этом ингибиторе взаимодействует своей боковой цепью с атомом серы дисульфидной связи Cys42-Cys58, а также с остатком His57 и О^-атомом Sen 95. С -атом остатка в Р' и его

а 1

карбонильная группа контактируют с боковыми*цепями остатков Sen 95 и Met192 [2011]. По мнению авторов работы (20113, некоторые из этих контактов вносят отрицательный вклад в общую энергию связывания, но эти неблагоприятные взаимодействия элиминируются в переходном состоянии реакции. Участок связывания Р2 остатка образован в химотрипсине "ложбиной" между остатками His4Q и Gly193. Наиболее важные конформационные изменения, происходящие при связывании субстратоподобных ингибиторов, можно проследить на примере взаимодействия протеазы А из Streptomyces grlseus с тетрапептидом AcProAlaProTjT-ОН (30633. Они заключаются в,следующем: а) С*- и 07-атомы Sen 95 перемеща-

о "

ются соответственно на 0,21 и 0,46 А в сторону от пептида; аналогичное, но более сильное смещение наблюдалось [31113 в комплексе трипсина с трипсино-вым панкреатическим ингибитором; б) имидазольное кольцо His57 сдвигается

примерно на 0,2 А (по атому Ne2) в сторону пептида и в) карбонильная группа

о

Ser214 сдвигается на 0,24 А в направлении пептида-..

Кроме того, на примере комплекса химотрипсина с формилтриптофаном [1329З отмечался поворот боковой цепи остатка Metl92 вокруг Са-Ср-связи примерно на 120°. При этом цепь Metl92 переходила из экспонированного в раствор состояния в более глубокие слои глобулы так, что прикрывала боковую цепь субстрата от контакта с водой. Эта роль остатка Met192 подтверждается также кинетическими [3112] и физико-химическими (2292,3113,31143 исследованиями.

Как видно, конформационные изменения сериновых протеаз при связывании лигандов незначительны и затрагивают боковые цепи аминокислотных остатков фермента. Исключение составляет, по-видимому, субтилизин BPN', для которого зарегистрировано [3060] перемещение основной цепи в области остатков 125-

о

127 (нумерация субтилизина) примерно на 0,5 А.

19*

Суз 42-S-

-н3с^

/

' I . ' I 1

His

Arg 17

\ ''__-С Met 192

Ala 16 \ч

СН \

'¦X IV

HN.

О —NH /

С—Set 195

^IN-Gly 193

<^Lys 15

292

Глава шестая. Фермент-субстратные комплексы

Рис.98. Стереоизображение комплекса BocAlaProNHCH(CHgCHMeg)B(OH)g (выделено жирной линией) в активном центре а-литической протеазы [2876]

Рентгеноструктурные исследования пептидов, кетоаналогов субстратов и производных борных кислот [2876,3039,3051,3062] позволяют составить представление о положении тетраэдрических промежуточных соединений в активных центрах сериновых протеаз (см. рис.98).

Исследования комплексов химотрипсина с различными ингибиторами методами ЯМР (3115-31181 в целом подтверждают характер взаимодействий, наблюдающихся для кристаллов фермента. Следует отметить, что кристаллы химотрипсина и протеазы А были получены при рН«4, т.е. в таких условиях, когда ферменты теряют активность. Однако в случае протеазы А кристаллы все же гидролизуют пептидный субстрат [3063], а кристаллы химотрипсина, полученные при более высоких значениях рН [1222,3119], не имеют существенных отличий от кристаллов "кислой формы".

Причины первичной стереоспецифичности химотрипсина, как показали рентгеноструктурные данные, а также результаты ЯМР-комплексов с L- и D-трифтора-цетил-п-фторфенилаланином [3116,3117] и трифторацетилтриптофаном [3015], заключаются в том, что ацильная группа ?>-изомера ориентирована в комплексе в направлении пары Ser195-His57, тогда как правильная ориентация 1-изомера позволяет этой группе образовывать связь с СО-группой Ser214.

Расчеты методами молекулярной механики показали, что в тетраэдрическом промежуточном соединении L-AcTrpOH на 9 ккал/моль стабильнее, чем D-форма [30151. Отсюда делается вывод, что стереоспецифичность проявляется в переходном, а не основном состоянии субстрата. Подобные расчеты комплексов BPTI с трипсином [3094,3120,3121] подтвердили представление [1235,30951 о том, что причиной ингибиторных свойств этого и сходных ингибиторов является жесткость фермент-ингибиторного комплекса и экранирование в комплексе остатка гистидина-57 от воды.

Цистеиновые протеазы. Данные рентгеноструктурного анализа комплексов

6.5. Структура комплексов

293

цистеиновых амидгидролаз с субстратоподобными соединениями сравнительно не-мночисленны. Имеются сведения о структуре папаина, ингибированного хлорме-тижетонами [3122], комплексов этого фермента с микробными ингибиторами Е-64 [3069] и Е-64с [2735], а также модель комплекса папаина с цистатином куриного яйца (на основе рентгеноструктурных данных для фермента и ингибитора [2797]). Как уже указывалось, папаин специфичен к пептидам, содержащим ароматическую аминокислоту в положении Р2. Активный центр этого фермента представляет собой "щель", расположенную между двумя доменами белковой молекулы. Длина "щели" такова, что в ней могут расположиться семь аминокислотных остатков - четыре в подцентрах S1-S4 и три в подцентрах S^-S^.

Анализ структуры папаина, модифицированного по SH-группе остатка Cys25 хлорметилкетонами ZPheAlaCH2Cl и AcAlaAlaPheAlaCHgCl (рис.99), показал, что

РИС.99. Стереоизображение участка активного центра папаина, модифицированного бензилоксикарбонил-Х-фенилаланил-Х-аланилхлоркетоном [3122]

остаток фенилаланина занимает участок S2, образованный остатками Туг67, Рго68 и Тгр69 одного домена и остатками Phe2Q7, А1а160, Val133 и Val157 другого домена белка. При этом происходит вытеснение молекулы воды- Карбонильная и NH-групш этого остатка ориентированы в направлении пептидной связи Gly65-Gly66 и могут образовывать с ней водородные связи. С^-атом остатка Phe образует Ван-дер-ваальсовы контакты с С° Рго68 и С^ А1а160, а фе-нильная группа контактирует в основном с остатками Val133 и Val157.

Аминокислотные остатки в положении Р1 располагаются вблизи основной цепи остатков Gly23 и Ser24 белка. Связывание остатка Р также приводит к вытеснению молекулы воды. Карбонильная группа Р1 направлена в сторону амидной группы боковой цепи Glyl9, однако расположение групп СО(Р1), Ne2 Gln19 и NH Cys25 не является опти

страница 45
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Химия протеолиза" (8.49Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
ремонт холодильников бронницы
посуда thomas cook pour
борцовки асикс
Купить дом в поселке Большое Сареево с бассейном

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(24.01.2017)