химический каталог




Химия протеолиза

Автор В.К.Антонов

оковая цепь этого остатка приобретает Ц мал/моль

практически полную свободу вращения вокруг связи Са-С в пределах х1 от -120 до +120° (рис.93). Глобальный минимум энергии этого остатка (при ^=90°) лишь на 2-3 ккал/моль

от угла вращения вокруг связи С -С (v.„)

Рис.93. Зависимость конформационной энергии боковой цепи Ser195 в а-химотрипсине

[3024]

j_I_1_I I 1_1_i_1_1

- 120 -90 -60 -30 0 30 60 90 120° X,

tss

282

Глава шестая. Фермент-субстратные комплексы

ниже, чем энергии других конформации.

Вообще, поскольку конформации аминокислот в белках совпадают с конформа-циями изолированных остатков, введение относительно небольшого лиганда вряд ли может внести существенные изменения.

Изучение спектров КД комплексов показывает, что обычно связывание лиганда изменяет эллиптичность в области поглощения ароматических фрагментов, но не затрагивает области поглощения пептидных групп (см., например: [3025-30271). Исключение могут составлять некоторые рН-зависимые конформационные переходы. Так, лиганды (индол, ацетилтриптофанамид) могут смещать равновесие между активной и неактивной конформациями химотрипсина, существующее при рН>8, в сторону активной формы. Это сопровождается изменением как дисперсии оптического вращения белка, так и изменением р#а группы 11е16, что приводит к поглощению протонов из среды [2307,3028]. Кинетика таких переходов подробно описана в работе [3029]. Сходные субстратиндуцируемые изменения наблюдались в бромелаине (23091.

Кристаллографические исследования комплексов амидгидролаз с субстратопо-добными соединениями позволили идентифицировать ряд конформационных изменений, характер которых будет подробно рассмотрен в следующем разделе.

Эффективным способом регистрации конформационных изменений является введение "репортерных" меток. В качестве таких меток могут служить хромофорные труппы (30301, спиновые метки [30311, флуоресцентные метки [3032] и т.п. Хорошим примером использования этого подхода служит исследование карбоксипептидазы А, модифицированной азосочетанием по остатку Туг248 с диазоарса-ниловой кислотой (1964 и цит. в ней лит.]:

Арсанилазогруппа координирована в молекуле карбоксипептидазы А с ионом Zn2+, что приводит к появлению интенсивной полосы при 510 нм и соответствующей полосы в-спектрах кругового дихроизма. Связывание субстратов, конкурентных ингибиторов фермента, и некоторых других соединений приводит к исчезновению этой полосы вследствие конформационных изменений, нарушающих связь азогруппы с металлом. Эти исследования выявили наличие нескольких участков связывания-лигандов в активном центре карбоксипептидазы. Замена в карбоксипептидазе А иона Zn2+ на "Со2+ позволяет использовать изменение, происходящее в ферменте при связывании лигандов методом магнитного кругового дихроизма [-30331. Комплексы арсанилазо-(Туг248) -карбоксипептидазы А были исследованы также методом Раман-резонансной спектроскопии (3034,30351.

Следует отметить, что в комплексах ферментов с лигандами часто сохраняется возможность свободного вращения и перемещения групп лиганда (например: (30361). Возможно, что поле белка, как это отмечено для кристаллического поля (30371, может даже способствовать свободному вращению.

-Ш-СН-СО-

6.5. Структура комплексов

283

6.5. Структура комплексов

Наиболее полную информацию о структуре комплексов ферментов с субстратами: дают кристаллографические исследования. Имеются данные о структуре довольно большого числа комплексов амидгидролаз с субстратоподобными соединениями, "квазисубстратами" и ингибиторами, т.е. веществами, практически не подвергающимися химическому превращению в условиях кристаллографического эксперимента. Кроме того, известна структура ряда производных амидгидролаз, имитирующих различные стадии ферментативного катализа (табл.69).

Следует подчеркнуть, что выводы о- структуре комплексов ферментов с истинными субстратами, делаемые на основе этих данных, следует воспринимать с известной осторожностью.

Таблица 69. Рентгеноструктурный анализ комплексов и производных амидгидролаз

Фермент Лиганд или производное* Разрешение-,, о A R-фактор Литературный источник

а-Химотрипсин For-i-TrpOH n-CH3C6H4S02-E 2,0 | 2,0 -• [1329] [1221 ]

Ind-CH=CHCO-E n-RC6H3(OH-o)CH=CHC0-E 2,5 1 ,9 0,203 [1328] [3038]

сн2=снсн=с(CH2Ph)CO-E 1 ,9 0,195 [2700]

c6h5ch2ch2b(oh)2 1 ,8 0,2 [3039]

SLPI BPTI (модель) OMT-3 2,3 2,0 1,8 0,19 0,168 [3040] [3041 ] [3042]

Трипсин Бензамидин BPTI SBTI PSTI APPA 1 ,9 1 ,9 2,6 1 ,8 1,4 0,23 0,195 [1233] [3043, 3044] [3046] [3095] f [3045]

Панкреатическая эластаза TfaLysAlaMHC H CF3-n AcAlaProAla BocValNHC6H3(M-Cl)(o-COO-E) 2,5 1,65 : 1,76 0,21 1 0,184 0,172 [3047] Г 3048] [3049]

ThrProVal-N-Me-LeuTyrThr AcAlaProValCF2 CONH(CHg)2 CgHg 1 ,8 1,78 0,190 0,16 [3050] [2887]

Лейкоцитарная эластаза MeOSucAlaAlaProValCHg-E 0MT-3 1 ,84 1,8 0,164; 0,21 [3051] [3052]

Тромбин r>-PheProArgCH2 -E 1,9 0,171 [3053]

Калликреин А BPTI 2,5 1 0,23 [3054]

а-Литиче екая BocAlaProNHCH(CHMe)g В(OH)2 2,0 0,138 [2876]

протеаза MeOSucAlaAlaProNHCH(R)B(OH) [R=Me,Ph и др.] 2,0-: -2,15. 0,142-! 0,147 [3055]

Субтилизин Карлсберг Эглин С 1,2 0,178 [3056]

Субтилизин BPN' CI2 SSI BzArgOH ZGIyGIyTjrrOH AcAIaGIyPheCH -E 2,1 2,6 2,5 2., 5 2,5 , 0,193 i 0,34 [3057] [3058] [3059] [1330] [3060]

184

Глава шестая. Фермент-субстратные комплексы

Таблица 69 (продолжение)

Фермент Лиганд или производное* Разрешение, о A R-фактор Литературный источник

PheAlaLysCH2-E 2,5 0,229 [3061 ]

с6н5в(он)2 2,5 - [2875]

Протеаза А Химостатин 1 ,8 0,123 [3062]

Streptomycee AcProAlaProPheOH 1 ,8 0,133 [3063]

grleeue AcProAlaProTyrOH 1 ,8 0,122 [3063]

AcProAlaProPheCHO-E 1 ,8 0,142 [3063,

3064]

Протеаза В BocAlaXJlyPheCH -Е - - [3065]

Streptomycee омт-з 1,8 0,125 [3066]

grleeue

Термитаза Эглин С 1 ,98 0,165 [3067]

Протеиназа К ZAlaAlaCH2-E 2,2 0,22 [3068]

Папаин' Е-64 2,4 0,233 [3069]

Е-б4с 2,5 0,269 [2735]

Цистатин (модель) - - [2797]

Пепсин НРпе(12)Туг0Ме 3,0 - [3070]

Пеницилло- IvaValValStaOEt 1 ,8 0,131 [3071,

пепсин 3072]

IvaValValLystaOEt .1 ,8 0,144 [3072]

Эндотиапепсин ProThrGluPheCH NHPheArgGlu 2,0 0,2 [2612]

BocPheHisNHCH(СН Ph)СН(OH)NCOLysPhe

1 Me2CHCH2C 1 ,8 0,16 [3073]

BocHisProPheHisS tabeuPheNH2 2,2 0,17 [3074]

Ризопуспепсин Пепстатин 2,5 0,265 [3075]

C-HisProPheHisPheCH NHPheValTyr 1 ,8 0,147 [3076]

Карбоксипеп- BzPheOH 1 ,8 0,187 [3076]

тидаза А F3CC0CH2(CH2Ph)COOH 1 ,7 0,172 [3078]

HGlyTyrOH (при -9°C) 1,6 0,178 [3079]

HGlyTyrOH (с апоферментом) 2,3 - [1288]

BocPheCH2CH(CH2Ph)COOH 1 ,75 0,236 [3080]

ZGlyPO NHPhe 2,0 - [2628]

ZAlaNHCH(СН )Р(ОН)(=0)ОСН(СН Ph)СООН 2,0 0,193 [3081]

PCI 2,5 0,196 [3082]

Термолизин ZPheOH 2,3 - [3083]

с6н5сн2сн(COOHjCHgCOOH [3084]

C,Hc(CH„)„COPheOH 2,3 - [3083,

6 5 2 '2 3085]

ValTrp [3086]

Ph (СН ) СН(СООН)ValNHCH(СООН)СН Тгр 1 ,9 0,171 [3087]

E-CH2C0N(OH)LeuOMe 2,3 0,17 [2695]

HSCH2CH(CH2Ph)COGlyOH (S) 1 ,7 0,183 [2629]

HSCH2CH(CH2Ph)NHC0CH2C00H (Д) 1,7 0,187 [2629]

(H0)2P(02)MHLeuNH2 1,6 0,179 [2893]

ZGlyPLeubeuOH 1,6 0,177 [2728]

ZPhePLeuAlaOH 1,7 0,17 [2728]

Фосфоамидон 2,3 [3085]

6.5. Структура комплексов

285

Таблица 69 (окончание)

Фермент

Лиганд или производное

Разрешение,

R-фактор

Литературный источник

D-Ala-D-Ala пептидаза

Цефалоспорин С

2,3

0,106

[3088]

Ind - индолил; SLPI - секреторный лейкоцитарный ингибитор

протеаз; BPTI - основной панкреатический трипсиновый

ингибитор; 0МТ-3 - третий домен овомукоида индейки;

SBTI - соевый трипсиновый ингибитор; PSTI - панкреатический

секреторный трипсиновый ингибитор; АРРА - гг-амидинсфенилпиро-

виноградная кислота; CI2 - химотрипсиновый ингибитор 2 из зерен

ячменя; SSI - субтилизиновый ингибитор из Streptomyces;

Е-64 и Е-б4с - см. разд.5.9-6; Sta - статин; Lysta - 4,8-диамино-

3-оксиоктановая кислота; РСТ - ингибитор карбоксипептидазы

картофеля; GlyP и PheP - фосфорные аналоги Gly и Phe (NHCH Р0?).

В этом разделе мы остановимся на некоторых общих вопросах структуры комплексов амидгидролаз, а затем подробно рассмотрим отдельные примеры, касающиеся структуры комплексов представителей четырех групп рассматриваемых ферментов.

6.5.1. Конформация субстрата в активном центре

Необходимым условием образования стабильного комплекса фермента и лиганда является комплементарность взаимодействующих участков реагирующих молекул. Комплементарность можно определить (3089) как наличие в таких участках вза-

РИС.94. Участок Ван-дер-ваальсо-вой оболочки" [3089] молекулы а-химотрипсина

имно дополнительной Ван-дер-ва-альсовой оболочки (рис.94), так что наружные части одной молекулы совпадают с внутренними частями другой.

У конформационно-жестких лигандов тип Ван-дер-ваальсовой оболочки фиксирован, однако для большинства субстратов амидгидролаз как конформация, так и, еле- \^ / \ довательно, вид оболочки могут в определенных пределах изменяться.

Возникает вопрос: насколько соответвует конформация субстратов амидгидролаз в растворе и* в активных центрах ферментов?

Пределы конформационной подвижности пептидов относительно невелики - они возможны в рамках энергетически разрешенных областей, показанных на картах Рамачандрана (см. разд.1.4.2). Конформационные изменения в активных цент-

286 Глава шестая. Фермент-субстратные комплексы

pax амидги.дролаз при связывании субстратов также обычно невелики и носят локальный характер. Поэтому следует ожидать, что конформационные изменения субстрата при связывании ферментом не должны быть значительными.

Сходство конформации. производных Ы-ацетил-1-фенилаланйна в растворе и в активном центре химотрипсина было постулировано [20293 на основе сравнения кинетики гидролиза субстратов этого фермента, имеющих ограниченную конфор-мационную подвижность (см. рис.66). Аналогичный' подход был использован [30903 для доказательства вытянутой конформации боковой цепи остатка"I&s в комплексах с трипсином.

Этот вывод нашел подтверждение в исследованиях (30913 ЯМР-кОмплексов ацетил- и трифторацетилтриптофана с химотрипсином, резонансных Раман-спект-ров тиоацилпапаина и других цистеиновых протеиназ (3092,30933, а также в расчетах конформации субстратов методом атом-атомных потенциалов [3024, 30943. Наконец, результаты кристаллографического анализа комплексов химотрипсина с субстратоподобными ингибиторами окончательно подтвердили этот вывод (табл.70). Наблюдаемые отличия в конформации"-основной цепи субстрата иногда бывают связаны с особенностями кристаллической упаковки белка. Так, в кристаллах комплекса химотрипсина с формилтриптофаном ориентация лиганда, по-видимому, несколько искажена из-за препятствий, создаваемых--второй молекулой фермента, контактирующей с субстратсвязывающим участком [13293.

Таблица 70. Конформация основной цепиннекоторых аналогов субстратов в активных центрах амидгидролаз.1

Фермент Лиганд* Угол Двугранный угол в положении Литера-^ турный

рг Р1 ч источник

Трипсин BPTI Ф Ф -70 154 -120 49 -94 170 -112 79 [30443

SBTI Ф Ф - -135 -115 -89 85 - [3046]

Химотрипсин For-I-TrpOH i Ф Ф : -86 3 ' - : 11329, 3059]

Лейкоцитарная элас- ОМТ-3 Ф Ф -76 155 -99 29 -82 156 -104 106 [3052]

таза

Протеаза В Streptomyces ОМТ-3 Ф Ф -69 159 J-117 45 -83 153 « _99 115 [3066]

grleeue J ;-96-169

Субтилизин Карлссерг Эглин С < Ф Ф -61 143 -115 43 -117 110 [3056]

"Сокращения см. в табл.69.

Конформации лигандов соответствуют разрешенным областям для углов ср и ф на картах Рамачандрана (ср. табл.70 и рис.7). Заметные различия в. конфор-мациях могут наблюдаться для боковых цепей, но разница в энергиях таких конформации обычно мала. Так, ароматическое кольцо формилтриптофана при связывании поворачивается примерно на 60° по отношению к оптимальной кон-

6.5. Структура комплексов

287

формации в растворе [2029]. В случае субстратов пепсина оптимальной в растворе конформацией является такая, где AcPhePheNHMe не взаимодействуют друг с

Рис.95. Конформация AoPhePheNHMe [143]

а- конформация с параметрами: %\ 180°,

y*1 -60° и дС. .=0,6 ккал/моль; tot *

б- конформация ¦ с х1 -60°, %-\ 180° и

uG. =4,2 ккал/моль tot

Данные о конформации дипептида HPhe--Туг(12)0Ме в активном центре пепсина [3070] показывают, что эти два ароматических цикла принимают развернутую кон-формацию (рис.95).

Различие в полных энергиях этих двух - конформации составляет около 4 ккал/моль, однако эта энергия, по-видимому, компенсируется в комплексе за счет гидрофобных взаимодействий ароматических колец.

В некоторых случаях наблюдается заметное отклонение конформации амидной связи от плоской структуры в участках вторичной специфичности. Так, например, в комплексах зндотиапепсина с аналогами субстрата, содержащими остаток His в положении Рг-, амидная Pg-B, -связь имеет-ш=-168° (30731. Такое отклонение на 1-2 ккал/моль менее выгодно по сравнению с плоской структурой.

6.5.2. Состояние расщепляемой связи

Как уже отмечалось, амидная связь в растворе имеет почти плоскую конфигурацию, однако поворот вокруг связи С-N на величины порядка' 10-15°, а также небольшой выход карбонильного атома углерода из плоскости, образуемой атомами Са, 0 и N, не сопряжены со значительными энергетическими затратами (см. разд.1.2.1).

Исследования комплекса трипсина с бычьим панкреатическим ингибитором показали [3043,30441, что амидная группа ингибитора Lysi5-Alai6 заметно искажена так, что карбонильный атом углерода выходит из плоскости, образованной атомами Са, 0 и N (парамидализация). Дальнейший анализ структуры фермент-ингибиторных комплексов сериновых протеаз показал, что эта ситуация не является уникальной (табл. 71) и была довольно подробно проанализирована (30451.

Необходимо отметить, что в свободном бычьем панкреатическом трипсиновом ингибиторе %п для связи Lys15-Ala16 близко к нулю [30451.

Предполагалось (30431, что в комплексах с белковыми ингибиторами амидная группа ингибитора (Lys15-Ala16) имеет истинно тетраэдрическое строение, образуя ковалентную связь с гидроксильной группой остатка серина активного центра фермента. Однако дальнейшие исследования, главным образом методами 13С-ЯМР с использованием ангидроферментов, показали [2832,3097,3098], что такая связь не образуется и тетраэдричность карбонила является, по-видимо-

оба ароматических кольца дипептид

страница 44
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Химия протеолиза" (8.49Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
котлы на твердом топливе висман
москва с/к олимпийский ледовое шоу черномор
купить тумбу под телевизор в икеа
влок в химках

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(08.12.2016)