химический каталог




Химия протеолиза

Автор В.К.Антонов

aS*=2,4 э.е.).

6.2.3. Стадийность комплексообразования

Появляется все больше данных о том, что белок-лигандные взаимодействия происходят в две или несколько стадий. Это вполне понятно, так как такое взаимодействие сопровождается процессами десольватации реагирующих молекул, .образованием большого числа нековалентных связей и часто конформационными пе-

276 Глава шестая.- Фермент-субстратные комплексы

Таблица 67. Константы скорости образования и распада комплексов

амидгидролаз с лигандами: Е + L ^——¦» ЕЬ

*-1

Фермент Лиганд* V М"1с"1 Й_1Р с"1 Литературный источник

Химотрипсин PATrpNH 6.2.106 2,7-103 [2305]

AcPhepNA 1,5-107 4-Ю3 [2047]

AcTrpONp 1,3-Ю8 3,5-Ю3 [2967,

(6.107) (6-10Л) (2297)]

CPgCO-D-ТгрОН 1 ,5.107 - [2968]

Профлавин 1,5-108 2,15-Ю3 [2969]

Родамин 6G 1 ,2.102 3-Ю"3 [2565]

BPTI 1 ,2.108 8.3.103 [2970]

Химотрипсин 3,7-Ю3 0,68 [2971 ]

Трипсин BzArgpNA «10б - [2972]

SBTI 8,2-Ю6 (6,8-Ю6) (2,2.10-Д) [2973, (2974)]

BPTI 1 ,1 .10б ' 6,6-Ю"8) [2974]

LBTI 1 ,4-10б - [2973]

OTI 2,7-Ю6 - [2973]

Ангидро-трипсин BPTI SBTI 7.7.105 4-106 8,5-10"® 1 ,4-Ю-3 [2974] [2974]

Субтилизин BPN* SSI 3,1 -10б - [2975]

Папаин ZLyspNA 2.7.106 0,27-103 [2522]

Пепсин DnsPhePheOpp >1 -10б - [2976]

Пепстатин 7-Ю5 - [2977]

Термолизин Фосфоамидон -3** «5-10 - [2978]

*РА - фуроилакрилоил; ONp - n-нитрофениловый эфир; BPTI - бычий панкреатический трипсиновый ингибитор; LBTI - трипсиновый ингибитор из лимских бобов; SSI - белковый ингибитор субтилизина; Срр - 4-пиридиноцропиловый эфир; SBTI - соевый трипсиновый ингибитор; рШ - n-нитроанилид; OTI - овомукоид куриных яиц. **Константа скорости инактивации фермента псевдопервого

порядка (с ), оценка из графика [2978].

рестройками как бежа, так и лиганда. Осуществление всех этих процессе режиме диффузионно-контролируемой реакции представляется маловероятным.

Как отмечалось в предыдущем разделе, уже в случае двухстадийной сз комплексообразования наблюдаемая скорость может быть ниже, чем скорс контролируемых диффузией процессов.

Действительно, в случае процесса

6.2. Кинетика комплексообразования

277

fe1 кг

Е + I -—. ЕЪ •«-* ЕЪ (10)

константа скорости образования комплекса EL* в условиях [Elo«[Slo дается уравнением:

fe

fe2(S]c

-1

+ fe ?.

1 + - [SI

*-1 °

Если распадом комплекса EL* можно пренебречь, то при низких концентрациях лиганда (ft1/fe_ [S1q<1) наблюдаемая константа скорости второго порядка образования этого комплекса будет:

к^ fe2 k_ ^

к = - fe, = —, где К = -.

к . К а к,

-18 1

Таким образом, если даже первая стадия проходит с диффузионно-контроли-руемой скоростью (fe =1.109 с~1), а величина Kg лежит в области 1.10-3 М, наблюдаемые константы скорости второго порядка, равные в большинстве случаев 1-106—1 -107 М~1с~1 (см. табл.67), могут быть следствием того, что вторая стадия (fe2) проходит с константой скорости около 103—10Л с-1. Эти величины существенно ниже, чем скорости десольватации модельных соединений (108—1011 с-1 (2980,29811), но лежат в области типичной для констант скоростей кон-формационных изменений (1735,29791. Если fe1(SI /fe »1, то fe=fe2+fe_2 и наблюдаемая константа скорости может соответствовать fe2 (если fe_2«fe2) или fe_2.

К сожалению, имеется мало данных о величинах fe2 и fe_2 для типичных субстратов амидгидролаз (табл.68). В большинстве случаев такие исследования проводились с плохими субстратами или ингибиторами. Кроме данных, приведенных в табл.68, имеются качественные результаты, свидетельствующие о стадийности образования комплексов с амидгидролазами (2972,2976,2992-29971 и данные для ферментов других классов и неферментных белков (см., например: [2998-30031).

Структурные различия комплексов EL и EL* в большинстве случаев остаются неясными. Так, при взаимодействии субтилизина с арилборными кислотами имеются обоснованные данные [28641 о том, что первый комплекс является сорбци-онным, тогда как второй - продукт солеобразования борнокислого остатка и гидроксильной группы серина активного центра:

Е-ОН + РЬВ(0Н)2 E-0H-PhB(0H)2 [E-0B(0H)2Phl-Н4.

Во многих случаях регистрируются конформационные изменения фермента (например, с арсанилазотирозинкарбоксипептидазой А), ступенчатое вытеснение красителя (пепсин-пепстатин) или изменение флуоресценции субстрата (папаин, трипсин).

278

Глава шестая. Фермент-субстратные комплексы

Таблица 68. Константы скорости стадий образования и распада комплекса Eli* (схема 10)

Фермент ' Лиганд* Условия: г t°C (рН) с"1 -1 с Литера- туршй источник

Химо- FATrpNHg 15(6,7) 1,5** 30 [2982]

трипсин Dns-D-TrpOEt - 19 9 [2983]

Профлавин (8,4) 500 7000 [2984]

Трипсин DnsArgOMe 21 (7,1 ) «3 0,6 [2985]

Лейпептин -¦ 166 0,0017 [2986]

STI 1580 750 [29871

Субтили- - PhB(0H)2 15(6,5) 2420 262 [2864]

зин BPN', ж-ю2с6н5в(он)2 15(6,5) 332 24,6 [2864J

SSI 25(7) 774 - [2975]

Папаин MnsGlyValGlu- 25(6,5) 4000 15 [1820]

-LeuGly

Mns(Gly)2Val- 25(6,, 5) 2000 15 [1820]

-GluLeuGly

ZLyspNA -ЗО(-) 0,91 1 -10"5 [2522]

60% Me2S0

Пепсин Пепстатин 25(5) 600 «0 [2977]

Фактор CT—ингибитор - 3,5.10-Д - [2988]

С1в ком-

племента

Карбокси- HGlyPheOH 25(8) 3250 100 [2989]

пептида- HGlyTyrOH 25(8) 4030 271 [2989]

за А HGlylleOH 25(8) 1970 895 [2989]

(арса- HPheOH 25(8) 1156 1746 [2989]

нилазо-

Туг248)

Термоли- P-LeuTrpOH - 900 2,5 10~3 [2990]

зин Талопептин - 70 6,3.10"Д [2990,

2991 ]

"Сокращения см. табл.67, а также: STI - ингибитор трипсина из стрептомицетов; Mns - мансил; Р - - (0Н)2Р(= 0)-.

**См., однако: [2515]. <_ I

Во всяком случае, первый этап взаимодействия - это неполная "подстройка" фермента и лиганда. Для истинных субстратов амидгидролаз, очевидно, конечный комплекс (ЕЪ* или ES*) должен быть продуктивным фермент-субстратным комплексом. Первый же комплекс может быть результатом "заякоривания" субстрата ферментом по участку наибольшей специфичности, например участку первичной специфичности. Тогда можно себе представить, что вторая стадия заключается в реализации вторичных взаимодействий (вторичной специфичности) и она может сопровождаться конформационными перестройками, вызывающими изменение структуры фермент-субстратного комплекса. Следствия таких представлений для понимания специфичности и эффективности катализа амидгидролазами будут изложены в разд.8.9.

6.3. Термодинамика

279

6.3. Термодинамика

Стабильность фермент-субстратного комплекса определяется изменением свободной энергии комплексообразования

aG = - RTlnK ,

о в*

где Ks=1/Ks, константа ассоциации фермента и лиганда:

Кв ЕЕ][S3

Е + S w=—* ES, К = -.

s [ESI

Как уже отмечалось, определяемые в кинетическом эксперименте константы михаэлиса во многих случаях не тождественны константам диссоциации фермент-субстратных комплексов. Последние можно определить независимым способом, например методами равновесного диализа, гель-фильтрации, по изменению спектральных характеристик ферменте или субстрата при их взаимодействии [1661]. Во всех случаях необходимо выбирать условия, когда химическое превращение субстрата не происходит.

Если, как это показано в предыдущщем разделе, взаимодействие фермента и субстрата происходит ступенчато, то определяемая константа ассоциации (Кд) может быть эффективной величиной. В условиях Шо«[Б]о для схемы

Кд К* Е + S - 8 - ES S - ES*

эта величина будет:

Кв „ [ES* ]

К' = -, где К = -.

s 1+К* ¦ s EES]

в

В том случае, когда равновесие сильно смещено в сторону ES* (К*»1) К'=К /К*, если же равновесие смещено в сторону комплекса ES (К*«1), то К'=К .

в в

Таким образом, наблюдаемое изменение свободной энергии может в зависимости от положения равновесия отражать или полное изменение в системе, приводящее к образованию комплекса ES*, или же только частичное изменение, связанное с образованием комплекса ES.

В связи со сказанным интересно рассмотреть ситуацию со связыванием субстратов пепсина. Для этого фермента не обнаружено каких-либо кинетически значимых стадий между комплексом Михаэлиса и стадией химического превращения [1749, 30041, т.е. величина й|=КЧ Многие субстраты этого фермента имеют практически одинаковые значения К^»1 -1СГ3 М при значительном различии в величинах feoat (см. табл.39), т.е. несмотря на значительные различия в структуре наблюдаемая стабильность их комплексов с ферментом практически одинакова. Данные по температурной зависимости [1907] показывают, что наблюдается небольшое систематическое увеличение энтальпии ассоциации и компенсирующее положительное изменение энтропии при переходе от "медленных" субстратов к "быстрым". В целом связывание субстратов определяется значительным положительным изменением энтропии, что можно трактовать 11375] как следствие процесса десольватации.

Эти данные хорошо СТЖ суют-;.; Я представлением о стадийности компле^л.о-

280

Глава шестая. Фермент-субстратные комплексы

образования в условиях, когда К*<1. Поскольку все исследованные субстраты имеют одну и ту же группу в участке первичной специфичности [Phe(N02) или Phel, напрашивается вывод о том, что в комплексе ES реализуются взаимодействия в основном только этого фрагмента субстрата с ферментом. Тогда остальные, вторичные, взаимодействия должны реализоваться в продуктивном комплексе (ES*), который быстро превращается в продукты реакции. Различия в скорости превращения и будут мерой вторичных взаимодействий. В разд.8.8 мы вернемся к анализу такого "запасания" свободной энергии для понижения активационного барьера химической стадии реакции, здесь же проанализируем вклад вторичных взаимодействий в катализ на примере двух соединений [1878]:

ZGlyGlyPhePheOpp с fecat/Km=1,78-105 IT1 с"1 и

ZAlaAlaPhePheOpp с fecat/Km=7,05.106 М-1 с-1.

Отношение этих констант соответствует изменению свободной энергии активации на 2,2 ккал/моль, что близко к вкладу гидрофобных взаимодействий (см. разд. 6.1.2) двух метальных групп, реагирующих с подцентрами S2 и S3 активного центра пепсина. Однако если в этих подцентрах (или других) происходят специфические взаимодействия (например, электростатические), то вклад вторичных взаимодействий может быть велик и может реализоваться ситуация, когда К*>1 (3005).

в

Вклад различных взаимодействий в свободную энергию, энтальпию и энтропию комплексообразования различен и зависит не только от типа взаимодействия, но и от структуры лиганда в целом, а также от энергетики сопутствующих связыванию процессов - изменения сольватации, рЖа групп белка, конформационно-го состояния и конформационных изменений фермента.

Гидрофобные взаимодействия, как правило, вносят очень малые изменения в энтальпию и контролируются главным образом энтропией ассоциации (см., например: (2470,3006)). Образование водородных связей сопровождается изменением энтальпии.

Процессы десольватации приводят к положительному изменению энтропии за счет увеличения числа трансляционных степеней свободы системы при высвобождении молекул воды. Подробно вклад различных факторов в энергию связывания ингибиторов термолизином рассмотрен в работах (2596,3007).

Десольватация играет важную роль при взаимодействии амидгидролаз с белковыми ингибиторами. Во многих случаях такое взаимодействие сопровождается положительным изменением энтропии (3008,30091 (см., однако: (ЗОЮ)). В случае небольших лигандов основную роль играют факторы, приводящие к отрицательному изменению энтропии (см. табл.57).

Имеется много работ, в которых энергия белок-лигандного взаимодействия рассчитывалась методами молекулярной механики или квантовой химии (см., например: (153,3011-3015)). Получаемые значения энтальпии связывания сильно зависят от метода расчета (см. также разд.6.6).

Суммарный тепловой эффект связывания лигандов зависит от рН среды и, очевидно, от ионного состояния групп белка в данных условиях. Это видно, например, из сравнения энтальпии комплексообразования с химотрипсином ряда ингибиторов при значениях рН 7,8 и 5,6 [2467,2468].

Вычленить вклад в термодинамические параметры комплексообразования кон-

6.4. Конформационные изменения

281

формационных изменений белка - весьма сложная задача. В этой связи интересно рассмотреть данные [2469,3016,3017], в которых сравнивалась термодинамика ассоциации различных лигандов с нативными и модифицированными по группам активного центра (Hls57 и Ser195) химотрипсином и трипсином.

Во-первых, связывание специфических субстратоподобных ингибиторов характеризуется значительно большим отрицательным изменением энтропии, чем связывание неспецифичных ингибиторов. Во-вторых, дегидратация Ser195 или метилирование Hls57 приводит к существенному положительному изменению энтропии ассоциации, что, по-видимому, объясняется большей подвижностью лигандов в комплексах с модифицированными белками и отсутствием в таких белках индуцированных лигандами конформационных изменений [2469]. Отмечено также [3018], что связывание лигандов с мономерной формой химотрипсина значительно более эффективно, чем с димером.

Таким образом, изменения свободной энергии, энтальпии и энтропии ассоциации зависят от очень многих факторов, которые не всегда поддаются учету.

Ниже (см. разд.6.6) мы попытаемся оценить полную энергию связывания фермента и субстрата на основании данных о взаимодействиях, реализующихся в комплексе, которые получены с помощью рентгеноструктурного анализа.

6.4. Конформационные изменения

Связывание субстратов и ингибиторов ферментами часто приводит к конформаци-онным изменениям белковых молекул, которые можно регистрировать спектральными методами (изменения в УФ-спектрах, спектрах флуоресценции, кругового дихроизма и т.п.), термохимическими методами (по изломам на графиках Аррениуса) и методами рентгеноструктурного анализа. Эти изменения могут быть очень небольшими и затрагивать лишь локальные участки молекулы белка, особенно ориентацию боковых цепей его аминокислотных остатков (см., например: [1375,1378,3019-3022]), а могут также быть связаны с изменениями азаимной ориентации доменов в белках (30231.

Динамическая подвижность белков - свойство белковой молекулы, не зависящее от наличия лиганда. Изменение конформации, индуцируемое лигандом, по-видимому, происходит в рамках тех состояний, которые разрешены и для свободной белковой молекулы. Например, расчеты методом атом-атомных потенциалов (30241 показывают, что боковая цепь остатка Sen95 в а-химотрипсине фиксируется в положении с Х-|=9а° sa счет водородной связи с молекулой воды. При связывании субстрата и вытеснении воды б

страница 43
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Химия протеолиза" (8.49Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
заказать марки чм 2018 по футболу в интернет магазине
кухонная посуда фислер
крокус сити 8 сентября людовик
ремонт холодильников gaggenau на дому в москве дешево

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(23.06.2017)