химический каталог




Химия протеолиза

Автор В.К.Антонов

олиз может приводить к фрагментам протеаз, сохраняющим каталитическую активность (см., например: (29361). Действительно, многие случаи автокаталитического расщепления ведут к активным формам (на-пример, превращение б-химотрипсина в а-химотрипсин). Однако глубокий автолиз неизбежно ведет к инактивации фермента.

5.13. Заключение

Каталитическая активность амидгидролаз изменяется под действием самых разных факторов. Два из них наиболее существенны: изменение зарядов ионизирующихся групп фермента, особенно групп активного центра, и конформационные перестройки белковой глобулы. Уже при активации зимогенов образование ката-

5.13. Заключение

269

литически активного белка связано в первую очередь с изменением конформации, приводящим к формированию связывающего субстрат участка активного центра. Изменение рН, температуры, ионной силы раствора также приводят к локальным или более общим конформационным перестройкам молекулы фермента. Таким образом, конформационная лабильность является, по-видимому, непременным условием активности и регуляции амидгидролаз.

Существование большого числа весьма специфических ингибиторов позволяет не только изменять активность амидгидролаз, но и исследовать структуру активных центров, в том числе и взаимное расположение функционально важных групп. Это особенно ценно при кристаллографическом изучении ферментов.

Глава шестая

ФЕРМЕНТ-СУБСТРАТНЫЕ КОМПЛЕКСЫ

В предыдущих главах мы познакомились со структурой и свойствами участников процесса ферментативного гидролиза амидной связи, а также с важнейшими экспериментальными фактами, касающимися самого процесса. В этой и следующей главе мы проследим детально за всеми событиями, происходящими в ходе катализа, анализируя их с точки зрения структуры взаимодействующих веществ. К сожалению, в настоящее время это можно сделать лишь на ограниченном числе примеров, для которых, главным образом благодаря успехам кристаллографии белков, имеется достаточно детальная'картина происходящих событий.

В основе всех представлений современной энзимологии лежит идея об образовании фермент-субстратного комплекса. Эта идея проверена и получила подтверждение многими прямыми и косвенными методами, важнейшие из которых были уже рассмотрены выше и будут рассмотрены в ходе дальнейшего изложения.

6.1. Силы взаимодействия

6.1.1. Дисперсионные взаимодействия

При сближении двух атомов между ними возникают два типа взаимодействий -силы отталкивания, обусловленные взаимодействием электронных оболочек, и

Е ккал1моль ОН

0,3

ог

i

0.1

0.1

с-с

силы притяжения, или дисперсионные силы [2937 3. Последние пропорциональны 6-й степени расстояния между атомами, тогда как силы отталкивания пропорциональны 12-й степени расстояния. Полная потенциальная энергия взаимодействия выражается уравнением:

U = А/г

12

В/г"

(1)

где А и В - константы (рис.90).

Рис.90. Потенциальная энергия взаимодействия между двумя атомами водорода и двумя (тетраедричес-кими) атомами углерода в молекуле белка г - Ван-дер-ваальсово межатомное расстояние

Силы притяжения обусловлены взаимным индуцированием в нейтральных атомах или молекулах так называемого мгновенного дипольного момента, определяемого флуктуациями электронной плотности. Расстояние, соответствующее минимуму потенциальной энергии , называется Ван-дер-ваальсовым радиусом атома (табл. 66).

В сложных, и особенно белковых, молекулах эти расстояния могут быть несколько меньшими [29403. Энергия дисперсионного взаимодействия весьма невелика (см. табл.66) [2939 3- Однако наличие в молекуле белка или в области

6.1. Силы взаимодействия

271

Таблица 66. Ван-дер-ваальсовы радиусы атомов и групп и энергия взаимодействия между одноименными атомами [2938,2939]

Атом или группа о Радиус, А Энергия, ккал/моль

Н 1 ,4 0,0186

0 (в ОН) 1,5

0 (в СО) 1,7 0,0519

О- (в С00") 1,8

С (тригональный) 1 ,7 0,4519

S 1 ,8

N (амид)' 2,0 0,1366

N4 (ImH+) 1,55

СН (тетраэдрический) 2,1 0,0679

СН (ароматический) 1 ,8

контакта фермента и субстрата большого числа взаимодействующих атомов делает вклад дисперсионных сил в общую энергию связывания довольно значительным (см.разд.6.3).

6.1.2. Гидрофобные взаимодействия

Гидрофобные взаимодействия возникают за счет перестройки системы водородных связей воды вблизи неполярной гидрофобной группы.

В результате такой перестройки локальная упорядоченность растворителя увеличивается, что приводит к уменьшению энтропии системы. Чтобы компенсировать это неблагоприятное изменение энтропии, вода вытесняет гидрофобную молекулу или группу в гидрофобную область белка. Таким образом, возникают гидрофобные взаимодействия (см. обзоры: (2941-2944)).

Свободную энергию гидрофобного взаимодействия можно определить из константы равновесия при распределении данного вещества между водой и некоторым растворителем, например н-октанолом (2942):

Шокт

ag. = -дтш -. (2)

h [А]

и;

Это взаимодействие характеризуют также константой гидрофобности Ганча: % = lg((A] /[А] ). (3)

° ОКТ li>

Значения aG^ и % для аминокислот приведены в табл.9.

Детальный анализ растворения углеводородов в воде показал (29451, что вклад изменения энтальпии в свободную энергию гидрофобных взаимодействий все же довольно большой. В расчете на одну CHg-rpynny дНо=-0,57 ккал/моль, a TaS=+0,34 ккал/моль. Гидрофобность изменяется с изменением площади поверхности молекулы, взаимодействующей с водой (2943,29441. Эмпирически ус-

тановлено, что изменение энергии гидрофобного взаимодействия на 1 А площа-

272

Глава шестая. Фермент-субстратные комплексы

ди составляет 20-25 кал/моль.

Микросреда активных центров многих ферментов существенно менее полярна и обладает меньшей диэлектрической проницаемостью, чем вода. Это следует из данных по изменению спектров красителей при их адсорбции ферментами [2946]. Диэлектрическая проницаемость микросреды активного центра химотрипсина оценивается величиной е<10, т.е. близкой к диэлектрической проницаемости окта-нола. Однако гидрофобность активных центров амидгидролаз часто оказывается выше, чем гидрофобность модельной среды - октанола. В разд.4.3.2.2 был приведен ряд примеров корреляций констант скорости реакции и гидрофобности боковых цепей субстратов с наклоном, превышающим единицу. Такая же зависимость наблюдается для значений Kt некоторых ингибиторов (например, замещенных форманилидов [2000]). Это обусловлено тем, что в воде гидрофобные взаимодействия возникают только при введении неполярного соединения, тогда как в ферменте гидрофобная полость сохраняется и в отсутствие гидрофобного ли-ганда. Поэтому в зависимости от структуры'лиганда и фермента может реализоваться больший выигрыш в энергии за счет гидрофобных взаимодействий, чем при переносе вещества из воды в октанол.

6.1.3. Водородная связь

Характеристики водородных связей для ряда модельных амидсодержащих соединений были рассмотрены в разд.1.2.3. (см. также обзор: (72)). Здесь необходимо подчеркнуть, прежде всего, что энергия водородной связи сильно уменьшается в полярных средах. Вклад незаряженной водородной связи в энергию комплексообразования лиганда с белком оценивается в 0,5-1,8 ккал/моль (2947).

Преимущественный вклад в свободную энергию образования водородной связи вносит энтальпия (см. табл.4). Это справедливо для соединений, образующих одну водородную связь, так как при этом изменяются лишь трансляционные степени свободы. Для соединений с двумя и большим числом водородных связей при их образовании теряются также и вращательные степени свободы и энтропийный вклад становится больше. Отмечено (2948) существование компенсационной зависимости дНо и aSq при образовании водородной связи.

Прочность водородной связи зависит от значений рКа, образующих связь соединений, и соответственно от электронных свойств заместителей (2949,2950), причем электроноакцепторные заместители, например в фенолах, увеличивают прочность Н-связи (рис.91).

Заместители в феноле (а): 1— М-01; 2- п-1; 3- п-С1;

4- Н; 5- Л1-СНз ; 6- n-CHjO;

7- n-mpem-бутил; а- п-сн3;

в пиридине (б):

1- 4-трет-бутил; г- 4-СН ;

3- 4-С2Н5; 4- 3-СН3; J

5- Н; 6- З-Вг; 7- 3-CN; в— 4-CN

Рис.91. Влияние заместителей на константы ассоциации за счет водородных связей в фенолах (а) и пиридинах (б) в четыреххлорис-том углероде [2950]

6.1. Силы взаимодействия

273

6.1.4. Электростатические взаимодействия

Эти взаимодействия являются наиболее дальнодействующими при образовании фермент-субстратных комплексов, поскольку их энергия обратно пропорциональна 1-й степени расстояния между ионами (см. обзор: (2410, гл.71).

В водном растворе ионы сольватированы, причем энергия сольватации весьма высока. Так, для карбоксильной группы в воде она составляет около 65' ккал/моль (29391. При возникновении ионной пары между заряженными грушами бежа и субстрата освобождается сольватирующая вода, что приводит к увеличению энтропии системы. Однако молекулы воды внутри белковой глобулы или в области белок-белковых контактов могут служить "мостиками" электростатических взаимодействий, давая значительный вклад в стабилизацию комплексов [2951 ].

Вклад ионных взаимодействий в общую энергию стабилизации комплекса оценить довольно трудно. Было показано [2306], например, что локализованная внутри глобулы а-химотрипсина ионная пара, образованная карбоксилат-ионом остатка Asp194 и аммонийной группой остатка 11е16, дает вклад в стабилизацию структуры фермента около 3 ккал/моль.

оценить эту величину из сравнения Кд или Kt субстратов и ингибиторов, как правило,, затруднительно, по-видимому, вследствие того, что часть энергии взаимодействия расходуется на конформационное изменение фермента. Так, значение Кд для двух субстратов трипсина

CAHtC0NHCHC00CHQ CAHcC0NHCHC00C,Hc

CHgCI^CHgCHgCHg CH2CH2CH2NHC(=NH)NH2

I II

равно соответственно 0,1 и 262 мМ, т.е. заряд в соединении II дает отрицательный вклад в связывание. Однако разница в свободных энергиях активации (по кг/Ке) для пары AcLysOMe и АсНерОМе составляет 5,9 ккал/моль [19791, что в значительной степени может быть отнесено к ионному взаимодействию. Это согласуется с результатами, полученными при направленном мутагенезе трипсина (2952]. Замена остатка Asp189 в субстратсвязывающем кармане фермента на остаток Бег снижает fecat по отношению к Lys- и Arg-содержащим субстратам на 5 порядков, тогда как Кт увеличивается лишь в 2-6 раз. Взаимодействие заряженной группы субстрата с карбоксилат-ионом остатка Asp189 в трипсине дает вклад в свободную энергию связывания около 4 ккал/моль.

6.1.5. Другие типы взаимодействий

Между ароматическими циклами и между этими циклами и амидной группой возможны донорно-акцепторные ic-ic-взаимодействия, в том числе и образование комплексов с переносом заряда. Модельные комплексы такого типа исследованы в работах [2953-29551. В межмолекулярных комплексах с переносом заряда в органических растворителях константа ассоциации очень невелика (0,4-1,2 М-1), а энтальпия комплексообразования составляет -0,54-2,5 ккал/моль.

Теоретический конформационный анализ показал (1431 возможность взаимодействия ароматических колец фенилаланина с пептидной связью в пептидах this. в.к. Антонов

274

Глава шестая. Фермент-субстратные комплексы

па AcPhePheNHMe. Энтальпия такого взаимодействия составляет около -4 ккал на моль.

Было показано [2956,29571, что ароматические группы могут взаимодействовать с S-S-связью и атомами серы в белках. Энергия взаимодействия бензола с диметилдисульфидом составляет -3,3 ккал/моль:

О

6.2. Кинетика комплексообразования 6.2.1. Теория

движение молекул реагирующих веществ в растворе определяется скоростью диффузии, зависящей от размера молекул. Для незаряженных молекул сферической формы константа скорости диффузионно-контролируемой реакции двух молекул с радиусами Д1 и Д2, имеющих коэффициенты диффузии D и Т>г, будет [2958, 29591:

fed - 4lt(K1 + RB)(D, + D2)N/1000, (4)

где N - число Авогадро. Так как коэффициент диффузии выражается как КТ

D = -, (5)

61СТ)Д

где j] - вязкость раствора, то выражение для константы скорости можно записать в виде:

2RT(R, + it,) ЗОООт^Д,,

Ъл = ______ • (6)

Учет электростатических взаимодействий (в разбавленных растворах) может быть сделан на основе уравнения Дебая-Хюккеля [29601:

fed

lg — = z z А, (7)

где z1 и z2 - заряды взаимодействующих частиц; ц - ионная сила.

Это уравнение применимо при относительно высокой ионной силе (ц>0,01 [2961)) и для растворов белков - вблизи изоионной точки, где общим зарядом белковой глобулы можно пренебречь. Вдали от изоионной точки значительное влияние на скорость диффузионно-контролируемых реакций будет оказывать общий заряд белковой глобулы, а не только локальный заряд в радиусе соударения. Учет этого обстоятельства приводит [29621 к довольно сложному уравне-

о

нию, графическое представление которого для частного случая (^=25 А и Д2=3

о

А) показано на рис.92 [2963]- Модифицированное уравнение (4), учитывающее эти и некоторые другие факторы было предложено в работе [29641.

6.2. Кинетика комплексообразования

275

Зависимость фактора эффективности

Рис.92

t =ft*/fed от произведения зарядов белка и субстрата (влияние общего заряда белковой глобулы)

Ионная сила: в отсутствии NaCl; 2- 10 М;

10~2 М NaCl [2963]

Все эти данные позволяют оценить константу скорости диффузионно-контролируемых реакций как

108-1010 М-1 с 1

(2965).

Вязкость многих растворителей зависит от температуры (2966):

Ф

т) = Ае RT.

(8)

r,s 1.0

0,5 О

-0,5 -1.0 -1,5

W 20 О -20 -«7 lflz

Подставляя это выражение в уравнение (6) и логарифмируя, получим:

fe. = 1пЛ + ШГ--.

(9)

Отсюда видно, что .зависимость fed от температуры определяется в основном изменением вязкости. С этим согласуются прямые измерения вязкости раствора на каталитические константы ферментативной реакции (см..разд.4.4). Величина ср лежит в пределах 1-5 ккал/моль. Примерно в этом же диапазоне лежат свободные энергии активации диффузионно-контролируемых реакций.

6.2.2. Экспериментальные данные

Как видно из данных табл.67, скорость ассоциации во многих случаях сопоставима с доффузионно-контролируемыми величинами, хотя для некоторых комплексов наблюдаются отличия, которые нельзя объяснить вкладом электростатических взаимодействий. Особенно низкие скорости, наблюдаемые для взаимодействия родамина 6G или димеризации химотрипсина, по-видимому, обусловлены лимитирующей стадией конформационного изменения белка (2565). Скорости кон-формационных изменений лежат в области 102—10Д с-1 (2979).

Другая причина заниженных по сравнению со скоростью диффузии скоростей ассоциации может быть связана со ступенчатым ее протеканием. Подробнее этот вопрос будет разобран ниже.

Имеется очень мало данных о температурной зависимости скорости ассоциации. Было показано (2975), что при ассоциации субтилизина BPN' с белковым ингибитором наблюдаемое изменение свободной энергии активации почти полностью определяется энтальпией активации (aG*=8,91 ккал/моль и

страница 42
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Химия протеолиза" (8.49Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
сводные таблицы курсы
необычные светильники купить
купить галогеновые лампочки для авто
шкаф с ячейками для пропусков

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(04.12.2016)