химический каталог




Химия протеолиза

Автор В.К.Антонов

ми перестройками, что обнаруживается по- спектральным изменениям в белке [2880].

Было показано, что комплексообразование алкилборных кислот с некоторыми ферментами происходит ступенчато - сначала, вероятно, возникает координаци-

5.9 Ингибиторы

263

онная связь с имидазолом активного центра (EI), а затем происходит взаимодействие с остатком серина (EI*) [2861,2864,2880]:

K'i \ Е + I - EI ^-* EI*.

*-г

причем наблюдаемая константа ингибирования K{=KJ (1+ft2/ft_2).

Для реакции фенилборной кислоты с субтилизином BPN' были определены значения Kj=0,6 мМ и &2/&_2=9,25 [28641, а связывание соединения 8 (табл.65) с а-литической протеазой характеризуется значениями KJ=6,4 нМ и к2/к_г=9,6 (2861 ].

В качестве "аналогов переходных состояний" для амидгидролаз рассматриваются также аминоацил- и пептидилальдегиды [2860,2870,2881-2883], в том числе природные альдегиды - лейпептин, антипаин, химостатин, эластатиналь (см. разд.5.9.6). Ингибирующая способность альдегидов обусловлена образованием полуацеталей или тиоацеталей с каталитически активными группами сериновых или цистеиновых протеаз [2872,2884,28851 и сопровождается конформационными перестройками в белке [2886].

В разд.5.9.3 уже упоминались в качестве ингибиторов пептидилфторметилке-тоны общей формулы:

R-C0CP2-X,

где RCO - ациламинокислота или пептид, а X - Н, Р или пептид. Рентгено-структурные (28871 и ЯМР-данные (2888,28891 показывают, что эти соединения образуют с сериновыми и цистеиновыми амидгидролазами соответственно гемике-тали или гемитиокетали. Аналогично ведут себя пептиды - аналоги субстратов, у которых вместо расщепляемой пептидной группы содержится кетогруппа -СОСНг (см., например: (28901). Одним из признаков сходства ингибиторов с переходным состоянием субстрата является линейная корреляция LgK{ с LgX /к . (а не lgK ) (28911 -

ет m cat °^ m

В качестве аналогов переходного состояния рассматриваются также природные ингибиторы амидгидролаз - фосфоамидон и пепстатин (см. разд. 5.9.6) [28911. Рентгеноструктурные данные (2892,28931 показывают, что фосфорная группа своим атомом кислорода образует координационную связь с атомом цинка в термолизине, однако более близким к переходному состоянию является комплекс термолизина с (HO)2P(0)NHLeuUH2. В этом случае оба кислородных атома ингибитора связаны с Zn, т.е. последний становится пентакоординированным [28931-

В комплексе пепсина с пепстатином роль тетраэдрического атома углерода играет р-углерод остатка статика (27251 (подробнее см. гл.6.). Комплексооб-разование пепстатина с пепсином происходит ступенчато (28941.

Являются ли ингибиторы - "аналоги переходных состояний" - действительно аналогами переходного состояния субстрата в реакциях гидролиза? По моему мнению, этот термин весьма сомнителен.

Связывание борной кислоты, например с химотрипсином, и связывание ее с модельным соединением - амидом салициловой кислоты примерно одинаково

264

Глава пятая. Регуляция и влияние внешних факторов

UGQ= -1,4 и -2,1 ккал/моль соответственно [2848]), так что (Зорная кислота даже эффективнее связывается в модельном опыте. В то же время свободная энергия переноса фенилэтильной группы из воды в октанол (-4,2 ккал/моль [19711) равна свободной энергии переноса этой группы из воды в полость активного центра фермента. Таким образом, суммарное изменение свободной энергии при связывании фенилэтилборной кислоты ферментом (-5,6 ккал/моль) не выше, а даже ниже, чем свободная энергия связывания этого соединения с модельным веществом и энергия переноса в неполярное окружение (-6,3 ккал на моль). Повышенное сродство этих "аналогов переходного состояния" определяется просто дополнительными по сравнению, например, с эфиром гидрокоричной кислоты (дСо=3,7 ккал/моль (2468]) взаимодействиями в активном центре фермента. То же самое можно сказать об альдегидах, образующих ковалентную связь с каталитически активной группой фермента. Что касается пепстатина, то связывание его с пепсином (дСо=-12,4 ккал/моль) ухудшается при удалении гидроксильных групп (имитирующих, как предполагается [2725,2895], структуру переходного состояния), но приводит к снижению свободной энергии всего на 3,2 ккал/моль (2724). Это вполне может быть отнесено к образованию гидрок-силом слабых (или слабой) водородных связей с ферментом. В лучшем случае этот тип ингибиторов можно было бы назвать аналогами промежуточного тетраэдрического соединения.

Алкилборные кислоты оказались полезным инструментом для анализа топографии активных центров сериновых протеаз [2847,2862,28631. Исследование зависимости К{ от длины углеводородной цепи позволяет составить представление о расстояниях между каталитическим и сорбционным центрами и о протяженности последнего (рис.88).

6

1

У 1111

/ г ч я 1 1 i 1 1 1 i 1 1

г ч в в п

Рис.88. Зависимость констант ассоциации алкилборных кислот от длины алкиль-ной цепи (и гидрофобности) (а) и схематическое представление топографии активных центров амидгидролаз (б)

1- пенициллинамидаза; 2- мезентерикопептидаза; з- субтилизин;

4- химотрипсин; I- B(0H)2; II- алкильная цепь; III- каталитические группы

фермента; ту- гидрофобный участок

5.10. Активация

265

5.10. Активация

Ряд органических соединений активирует ферментативный гидролиз. К числу таких активаторов относятся суОстратоподобные соединения и соединения, имитирующие отдельные фрагменты субстрата. Для некоторых ферментов отмечается способность активироваться избытком субстрата (см. разд.5.9.3). Кроме того, хорошо известна активирующая роль ионов металлов. В этом отношении интересным примером является плазменный белок С, активность которого линейно зависит от квадрата концентрации ионов Na+ (2896,28971.

Кинетическая активация описывается тем же обобщенным уравнением (25) (см. разд.5.9.1), что и действие ингибиторов при значениях р>1 и а<1.-При а>1 в зависимости от соотношения аир будет наблюдаться ингибирование или активация.

Типичным примером активации субстратом является катализ карбоксипептида-зой А, где комплекс ES2 превращается в продукты реакции в 2-5 раз быстрее, чем комплекс ES (17381. Активация субстратом была также отмечена при катализе эластазой из лейкоцитов (28981 и некоторыми другими ферментами.

Катализ карбоксипептидазой А ускоряется также при введении ряда пептидов, не гидролизующихся зтим ферментом (28991- Такие пептиды обладают большим сродством к ферменту, чем субстраты, а комплекс ЕА (где А - активатор) лучше связывает субстрат, чем свободный фермент.

Сходным образом ведут себя аспартатные протеазы - пепсин и пенициллопеп-син (2900-29041. В случае пенициллопепсина гидролиз LeuTyrNH2 ускоряется негидролизуемым пептидом LeuGlyLeu, причем увеличивается &cat ф»10),

остается неизменной. Сродство фермента к активатору Кд=2-10~3 М (29003.

Детальное исследование активации пепсина (2901-29041 показало, что в зависимости от структуры субстрата и активатора активация может проходить по неконкурентному (а=1, р>1) и смешанному (а и р>1) типам. Значения р в отдельных случаях достигают 70. Обязательным условием активации оказалось наличие у субстрата и активатора, по крайней мере, по одной незащищенной концевой амино- или карбоксигруппы. Было установлено (29021, что при катализируемом пепсином гидролизе дипептида HPhe(N02)PheApm в присутствии трипепти-да ZPheAlaAlaOH активация происходит по механизму синтеза-гидролиза:

Е

ZPheAlaAlaOH + HPhe(N02)PheApm -

E

ZPheOH + HAlaAlaPhe(N02)0H <•-

ZPheAlaAlaOH + HFhe(I\TCL)OH -*-

2 E

Аналогичные данные были получены для других пептидов (2903,2904). Возможно, синтез-гидролиз играет важную роль и в случае активации гидролиза другими ферментами.

Связывание активатора аспартатными протеазами приводит к заметным кон-формационным перестройкам в ферменте, регистрируемым по изменению спектров кругового дихроизма (29003.

ZPheAlaAlaPhe(N02)PheApm

- ZPheAlaAlaPhe(N02)ОН +

HPheApm

266

Глава пятая. Регуляция и влияние внешних факторов

Чисто сорбционный тип активации наблюдается при трипсиновом катализе гидролиза короткоцепочечных эфиров ациламинокислот в присутствии алкиламмо-ниевых ионов [2905-2907]. В этом случае при постоянной длине боковой цепи субстрата чем короче алкильная цепь у активатора, тем эффективнее катализ. Алкиламмониевые ионы, по-видимому, взаимодействуют с катионным центром трипсина, способствуя правильной ориентации субстрата или индуцируя конфор-мационные изменения в ферменте, способствующие катализу.

Имеются данные [2908] о существовании белкового (молекулярная масса «20 кДа) активатора катепсина D из селезенки быка, увеличивающего активность фермента в отношении белковых субстратов на 50-300%. Этот фермент активируется также этиловым эфиром глицина [2909], фосфолипидами [2910] и АТР [2911,2912]. АТР-зависимая протеаза La Escherichia coll активируется ДНК [2913].

5.11. Аллостерические эффекторы

Следуя буквальному смыслу слова "аллостерический"(аАЛо? - другой, отереоС -пространство), к подобному типу эффекторов можно отнести некоторые из рассмотренных выше активаторов, а также неконкурентные ингибиторы ферментов. Так, в качестве аллостерических активаторов рассматривались соли триалкил-аммониевых производных азобензола [2914]:

ускоряющие катализируемый химотрипсином гидролиз анилидов N-ациламинокис-лот. Возможно, однако, что эти соединения просто препятствуют непродуктивному связыванию, характерному для анилидов, поскольку активации не наблюдается при использовании в качестве субстратов эфиров, гидроксамидов ациламинокислот, а также белков.

Свойства аллостерического эффектора трипсина обнаружены [2915] у дансил-аргинина. Это соединение связывается с ферментом как в активном центре (с К 6.7.10-3 М), так и вне его (с К 4.8.10"4 М).

m А

Более типичным случаем является аллостерическая активация карбоксипептидазы В в отношении неспецифических для нее субстратов типа ZGlyPheOH при введении в систему р-фенилпропионовой кислоты [2916]. При высоких концентрациях NaCl уже в отсутствие эффекторов наблюдается S-образная зависимость скорости гидролиза указанных субстратов от их концентрации. Активатор в низких концентрациях увеличивает скорость гидролиза, а при высоких концентрациях снижает ее. Эти факты были интерпретированы как следствие наличия у фермента двух центров связывания гидрофобных соединений, причем состояние одного из них - каталитического - зависит от связывания лигандов во втором цэнтре.

содным образом ведут себя такие соединения, как лизин, 6-аминогексано-вая кислота и др. в отношении катализируемого плазмином гидролиза эфира

СН3

СН3

где R = CH3 , СН2С6Н5

5.12. АВТОЛИЗ

267

Типичная для аллострических ферментов зависимость скорости от концентрации субстрата или¦эффектора может наблюдаться и в случаях, если фермент подвержен медленным конформационным переходам, как, например, щелочной кон-формационный переход в химотрипсине (см. разд.5.2.2) [29181, или же он способен к обратимой ассоциации [29191- Последний случай подробно исследован на примере глутаминазы из почек свиньи [2920-29221. В зависимости от типа буферного раствора (трис, фосфат или фосфат-борат) этот фермент существует в различных олигомерных формах с разной каталитической активностью. Фосфат-боратная форма имеет кажущуюся молекулярную массу около 1,5-106 Да и образует структуру типа двойной спирали [29221. Этот фермент аллостерически активируется красителем - бромтимоловым синим [29201.

Аллостерическим эффектором дипептидилкарбоксипептидазы (ангиотензинпрев-ращающего фермента) является ион хлора [2923,29241. В случае АТР-зависимой La-протеазы АТР также функционирует как аллостерический активатор [29251.

Истинно аллостерической протеазой является протеаза из эритроцитов овцы [4351. Этот фермент с молекулярной массой 340 кДа состоит из 6 идентичных субъединиц. Кинетика катализируемого этим ферментом гидролиза трипептида GlySerAla (но не GlyMetAla!) кооперативна с коэффициентом Хилла п=1,8. Близкое значение коэффициента Хилла было найдено (9571 для аминопептидазы I из дрожжей. Этот фермент (600 кда) состоит из 12 субъединиц и активируется ионами Zn2+ и С1~ (или Вт-). Галоиданионы действуют таким образом,, что снижают положительную кооперативность фермента по субстрату или по ионам Zn2+, приближая зависимость скорости от концентрации к гиперболической. Сходным образом ведет себя катепсин С [29261.

Наконец, следует отметить аллостерическое действие Clq-фактора системы комплемента на активацию С1S-C1г-факторов (29271 и сходное действие стреп-токиназы на активацию плазминогена (29281.

5.12. Автолиз

Автолитическое расщепление ферментов - свойство, присущее только протеазам. Оно заключается в катализе протеазой гидролиза амидных связей в молекулах того же фермента, подвергшегося частичной или полной денатурации. В простейшем случае кинетика инактивации фермента за счет автолиза описывается схемой:

EN -с-* Ер; Ер + Ew -• продукты,

где ED - денатурированная форма фермента, а соответствующее кинетическое выражение для скорости инактивации будет (24781:

Можно показать, что начальная скорость денатурации

. (Е1

1 о

v = 11m --In-,

° t-»o г [Elt

268

Глава пятая. Регуляция и влияние внешних факторов

1 о

где [ЕГ - концентрация Е„ в момент времени t. Из зависимости --In-- от

t N t tE]t

t, экстраполируя к t=0, можно получить значение йо=й{Кр - значение эффективной константы скорости денатурации. Для а-химотрипсина эти величины оказались равными 9 М-1с-1 при температуре 40°С и 100 М-1с-1 при температуре 49,5°С (рН 7,6) [2478). Как видно из уравнения для скорости инактивации, последняя зависит от квадрата начальной концентрации фермента, поэтому скорость автолиза очень быстро увеличивается с увеличением концентрации растворов протеаз. Заметный автолиз трипсина происходит даже при хранении лио-филизованного фермента [292]. Автолиз особенно эффективно происходит в оптимуме рН действия фермента, однако отмечены случаи автокаталитической инактивации и при значениях рН, сильно отличающихся от оптимальных [2929]. Даже при очистке трипсина на сульфоэтилсефадексе при рН 2,6 наблюдается заметный автолиз [2930]. Автолиз пепсина весьма заметно происходит при его кристаллизации [2931] ив растворе при различных воздействиях (рис.89) [2932]. Скорость автолиза отличается у ферментов разных групп. Так, экзо-пептидазы (карбоксипептидаза А и др.) довольно устойчивы в отношении самопереваривания [1213]. Более того, разные изоферменты химозина заметно различаются по скорости автолиза [2933,2934].

РИС.89. рН-Зависимость активности (А) и концентрации (С) растворимых в три-хлоруксусной кислоте продуктов автолиза пепсина [2932]

1- в водном растворе;

2- в 8 М мочевине;

3- в 4 М гуанидинхлориде

А(-) , С(-)

Автолиз может ускоряться различными соединениями. Так, дитиотриэтол и дитиоэритритол стимулируют автолиз папаина, тогда как меркаптоэтанол на этот процесс влияния не оказывает [29341- Автолиз химотрипсина промотирует-ся красителем голубым Эванса (29351.

Ранее считалось, что авт

страница 41
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Химия протеолиза" (8.49Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
DELL Latitude
как выровнять вмятину две рь на ваз 2110
снять в аренду микроавтобус без водителя
стул сп-1

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(12.12.2017)