химический каталог




Химия протеолиза

Автор В.К.Антонов

йства панкреатического трипсинового ингибитора Куница [2711,2712], семейства панкреатического секреторного ингибитора (Каваля) [27451, субти-лизинового ингибитора из актиномицетов [27601 и др.

Наиболее богатым источником белковых ингибиторов сериновых протеаз является плазма крови. Содержание ингибиторов в плазме доходит до 10% от общего содержания белков [27581. Наибольшую концентрацию в плазме имеет сц-антитрипсин (или а1-ингибитор протеиназ) [27611. Этот белок (М^ 52 кДа) ингиби-рует ряд сериновых протеиназ, но подавляет, главным образом, активность лейкоцитарной эластазы (27621. Известна его полная аминокислотная последовательность (27631 и пространственная структура [2764,2765]. В плазме содержатся также антитромбин III (27431, сц -антихимотрипсин (2751,27661, ag-антиплазмин [2767,2768], ингибитор белка С (27691, ингибитор С1-фактора комплемента [2742,2770] и ряд других ингибиторов системы комплемента (2771, 2772).

Вся эта группа ингибиторов среднего размера получила название "серпины" (от Serine Proteinase Inhibitors) [2758]. К "серпинам" относят и некоторые ингибиторы из других источников, например насекомых (27731-

Ингибиторы из поджелудочной железы человека и животных - это, главным образом, основной панкреатический ингибитор трипсина Куница и секреторный панкреатический ингибитор трипсина Казаля, которые упоминались выше. Они представляют собой небольшие белки (58 и 56 аминокислотных остатков соответственно), подавляющие активность не только, трипсина, но и ряда других сериновых протеиназ. Первый из них, исследован весьма подробно в структурном отношении (см. гл.6). Первичная структура второго была выяснена сравнительно недавно (27741. Ингибитор типа Куница содержится не только в поджелудочной железе, но обнаружен также в селезенке (27751 и плазме (27761. Эффективные ингибиторы сериновых протеаз обнаружены в семенной жидкости [2744,27771 И молозиве коровы (27461.

Ингибиторы сериновых протеаз весьма широкого спектра действия - овомуко-иды из яиц кур, индейки, а также улитки (2714,2778-27801. Овомукоид японской улитки - трехдоменный белок (186 остатков), один из доменов которого (III домен - 56 остатков), будучи выделен, подавляет активность сериновых протеиназ животных и микроорганизмов. Известна его пространственная структура (27781.

Богатым источником ингибиторов сериновых протеиназ является секрет медицинской пиявки. Весьма эффективным в отношении тромбина является гирудин -белок, состоящий из 76 аминокислотных остатков (2747,2781-27841. Другой ингибитор - эглин (27551 специфичен, в основном, в отношении эластаз и катеп-сина G. Еще в одном виде пиявок {Haementarla officinalis) обнаружен (2785, 2786] эффективный ингибитор фактора Ха - антистазин. Это белок из 119 аминокислотных остатков, содержащий 20 остатков полуцистина.

Яд змей {Russel viper, Vlpera ammoaytes и др.) содержит большой набор ингибиторов трипсина, химотрипсина, калликреина и плазмина (2664,27871-

Близкими к серпинам являются нексины, продуцируемые фибробластами и гли-альными клетками и подавляющие активность тромбина и урокиназы [27881.

Наконец, разнообразные ингибиторы сериновых протеиназ содержатся в семенах растений - соевых и лимских бобах (27891, зернах ячменя [27901, семенах

17. В.К. Антонов

258

Глава пятая. Регуляция и влияние внешних факторов

тыквы [27911 и др., а также у микроорганизмов, например ингибитор субтилизинов из Streptomyces [2792] и ингибитор активатора плазминогена из Escherichia colt [27931.

Активность цистеиновых протеаз подвержена регулированию большим числом специфических ингибиторов [27141- Важное значение имеют ингибиторы тканей и биологических жидкостей млекопитающих. Их делят на два больших класса -низкомолекулярные, включающие две группы - цистатины и стефины, и высокомолекулярные, главным образом, кининогены [27941.

цистатины - белки, содержащие около 115 остатков аминокислот и две ди-сульфидные связи Вблизи С-конца молекулы. К этой группе относятся наиболее изученные цистатины 1 и 2 из белка куриных яиц [2795-27971 и ряд аналогичных белков из тканей и плазмы человека и крыс, молозива, яда змей и др. [2798-28031. Яичные цистатины 1 и 2 отличаются наличием фосфорного остатка, связанного с Ser80 в нистатине 2 [28043. Стефины - белки, содержащие около 100 аминокислотных остатков и, как правило, не содержащие S-S мостиков [2805-28081.

Наконец, было обнаружено, что как низко-, так и высокомолекулярные формы кининогенов являются эффективными ингибиторами цистеиновых протеаз и содержат 2-3 участка, сходных по структуре с цистатинами [2794,2809-28111. Эволюционные взаимоотношения трех групп ингибиторов представлены на рис. 86 [2794, 28121.

1 КининогеныU "' .„,1 ' ;В2| 'А3 ;Вз] Рис.86. Эволюционные взаимо-(тлжслалцсш.) 1 ¦ 1 ' 1 отношения ингибиторов цистеи-

новых протеаз животных А- N-концевой фрагмент "внут-

^НБ-Глико-^_____I д г-g-j д j-g-j реннего длинного повтора" тя-

ПротеИН '-"-'-'-'-1- "Art- тiomf туттгтгтг^т^с-п^г, но тт^>_

Цистатины

Стефины

желой цепи кининогенов человека, В - соответствующий С-концевой фрагмент. Звездочками отмечены места потенциальных активных центров [2794, 2812]

Все зти ингибиторы подавляют активность папаина, фицина, катепсинов В, I и Н, дипептидилпептидазы I в пикомолярных концентрациях [2714,2813,2814], но не действуют на калпаины. Последние подавляются специфическим ингибитором, состоящим из 718 остатков аминокислот и содержащим 4 домена, каждый из которых взаимодействует с каллаитами [2815,28161.

Ингибиторы цистеиновых протеиназ широко распространены в растениях [2817-28191.

Значительно меньше сведений имеется в отношении белковых ингибиторов аспартатных и металлсодержащих протеаз. Пепсин и карбоксипептидаш подавляются ингибитором из гельминтов (Ascarts) [2820,28211. Известен ренинсвязы-вающий белок (Мг 56 кДа) - эндогенный ингибитор почечного ренина [28221.

Ингибиторы катепсина D, карбоксипептидазы А и термолизина обнаружены в картофеле [2823,28241 и томатах [28251- Это небольшие белки в 38-39 остатков аминокислот. Ингибитор термолизина из Streptomyces содержит 102 остатка [28261. Белок с Мг 36 кДа, подавляющий активность коллагеназы, выделен из костной ткани-кроликов №8271- Этот белок 'близок по структуре к тканевому ингибитору металлопротеиназ [28281.

5.9. Ингибиторы

259

Несколько особняком стоит ингибитор широкого спектра действия, содержащийся в-плазме крови - а2-макроглобулин• [2750,2757,27591 - Этот тетрамерный белок с- Мг 725 кДа состоит из двух, связанных нековалентно димеров, каждый из которых содержит две цепи, связанные дисульфидной связью. Он ингибирует практически все типы протеаз [2750,2759,28293.

Большинство белковых ингибиторов содержат в своей последовательности консервативные участки, являющиеся их активными центрами (табл. 64).

Таблица 64. Последовательность аминокислот в области активных центров некоторых белковых ингибиторов [2745,2758,2812,2815,2830]

Ингибитор Последовательность в области активного [центра

а1-Антитрипсин -Антиплазмин Антитромбин III а1-Антихимотрипсин 01-Ингибитор Панкреатический ингибитор Куница Секреторный ингибитор Казаля 3-й домен овомукоида индейки Ингибитор яда 'гадюки Русселя Ингибитор трипсина соевых бобов Цистатины Ингибитор калпаинов "Стрелкой указана расщепляемая шл расщепляемая амидная связь. ProMet-SerlleProPro Ser-ArgMetSerLeu GlyArg-SerbeuAsnPro beuLeu-SerAlabeuVal AlaArg-ThrValLeuVal •CysLys-AlaArglle TyrLye-IleTyr PreAfg-АврТуг CysArg-GlyHie ThrLys-Б erAsnProPro GlnVal-ValAlaGly Thrl1e-ProPro-X-Tyr Arg i потенциально

Среди ингибиторов сериновых протеаз имеются такие, которые действуют ¦. только, или преимущественно, на ферменты трипсиновой группы, и те, которые специфичны к химотрипсиноподобным протеазам. Однако довольно распространены и так называемые поливалентные, или "двухголовные", ингибиторы, подавляющие активность как трипсина, так и химотрипсина.

Решающее значение для активности белковых ингибиторов имеет относительно небольшой участок последовательности, включающий остатки основных аминокислот (Arg, IПредложен (2749) стандартный кинетический механизм ингибирования, который справедлив для большинства ингибиторов • сериновых протеиназ й ряда дру-

260

Глава пятая. Регуляция и влияние внешних факторов

гих белковых ингибиторов. Он заключается в образовании сначала некова-лентного комплекса EI, изомеризующегося в прочный комплекс (С), в котором может происходить расщепление определенной связи в ингибиторе с образованием "ацил-фермента". Последний затем деацилируется и образует "модифицированный" ингибитор (I*), который очень медленно диссоциирует из комплекса:

Е + I EI v—» С ^—* EI* -—* Е + I*.

Однако многие ингибиторы не подчиняются такому стандартному механизму С27571. Так, панкреатический трипсиновый ингибитор образует с трипсином стабильное соединение с заметно искаженной (пирамидализованной) амидной связью 1уз15-А1а16 (см. гл.6), а не ковалентную связь с остатком серина активного центра. Это подтверждается способностью модифицированных по активному центру ферментов (ангидротрипсин, Иег-метилгистидин-57-химотрипсин)

Эффективно СВЯЗЫВатЬ ИНГИбИТОр (2081,2832).

В четырех цистатинах, кроме указанного в табл.64 консервативного участка, важную роль играет сегмент Gly9-Ala10, который, возможно, расщепляется ферментом (2796), хотя по данным рентгеноструктурного анализа эта связь расположена далеко от тиоловой группы активного центра (2797).

С другой стороны, направленный мутагенез остатков аминокислот в области GlnValValAlaGly не влияет на связывание цистатина А с цистеиновыми протеи-назами (2833).

Ковалентную связь с ферментом образуют и такие ингибиторы, как ^-макро-глобулин (2834)- Для объяснения ингибиторных свойств этого белка была предложена (2835) гипотеза "захвата". Она заключается в том, что связывание ингибитора с ферментом сопровождается расщеплением ингибитора и существенными конформационными перестройками, приводящими к появлению свободных SH-rpyim, маскированных в нативном а2-макроглобулине в виде тиозфира с остатками Glu. Карбоксильные группы Glu образуют затем ковалентную связь с ингибируемым ферментом (2759, 2836-2839):

-Cys-Gly-GlU-GlU- E-eNH2 -Cys-Gly-GlU-GlU-

При связывании ингибитора карбоксипептидазы А из картофеля с ферментом происходит отщепление С-концевой аминокислоты ингибитора (2840), однако полученный укороченный ингибитор по-прежнему сохраняет способность связываться с ферментом. Модификация остатка активного центра Glu270 в карбоксипептидазе А предотвращает связывание ингибитора из Азсаг1з (2841,2842).

5.9.7. Ингибиторы - "аналоги переходных состояний"

Еще в 1946 г. Полинг (2843) обратил внимание на то обстоятельство, что субстрат в переходном состоянии ферментативной реакции должен связываться ферментом значительно эффективнее, чем в основном состоянии. Только в 1970-х годах эта идея была развита (2844,2845) и были предприняты попытки создать стабильные ингибиторы, имитирующие переходное состояние (см.обзор: (28461).

5.9. Ингибиторы

261

Таблица 65. Ингибирование амидгидролаз некоторыми аналогами переходных состояний

Фермент J* Ингибитор Kt, нм Литературный источник

а-Химотрипсин 1 AoLeuPheCHg 2,5-10* [2859]

2 сн3(снг)5в(он)г 2.7-106 [2847]

3 сбн5(снг)в(он)г 9-104 [2848]

4 cchcC0NHCH^B(0H)„ о Ь 2 2 5И03 [2849]

5 cchcCH^CH(NHCOCH,)В(0Н)^ о о 2 3 2 2.10J С [2850]

6 сбн5снгснгсно 3-10° [2860]

7 MeOSuo(Ala)gProNHCH(r)В(OH)2

8 Соедин.7, r=CH2c6h5 0,16 [2852]

Эластаза 9 To же, r=CHMe„ 0,57 [2852]

лейкоцитарная

Химаза 10 Соедин.8 58 [2853]

ct-Литическая - To же 68 [2861]

протеаза

Мезентерико- 11 сн3(снг)7в(он)2 1 ,58.10б [2862]

пептидаза 12 c6h5b(oh)2 0.63-106 [2862]

Субтилизин BPN' - Соедин.11 1.5-106 [2863]

" 12 6,2-Ю6 [2864]

Пенициллинами- 13 ch3(ch2)4b(oh)2 830 [2865]

даза

Трипсин - СоеДИН.1 89-Ю6 [2866]

14 NH„(NH-)CNHCch.CH„C0C00H 2 6 4 2 650 [2867]

Эластаза панк- Соедин.8 0,25 [2852]

реатическая

Аспарагиназ а 15 HOOCCH СН(NH )CH0 3,6 [2868]

EecherIchla

coll

Папаин 16 CgHgCONHCHgCHO 2.103 [2869]

17 AoPheNHCHg CHO 5,2 [2869]

18 ZLeuNleH* 138 [2870]

Калпаин I - Соедин.18 52 [2870]

Карбоксипеп- 19 HOCCHgCH(CHgPh)COOH 480 [2871]

тидаза А

Лейцинамино- 20 NH2CH(CH2Ph)B02r'** 60 [2872]

пептидаза

Ренин 21 BocPheValPheCF2CH2NH-{-Bu* 3,5 [2873]

**r* - пинаконовый эфир.

Первые такие ингибиторы амидгидролаз - алкилборные кислоты были получены и исследованы в 1968 г. (2847]. В последующие годы были получены многочисленные ПрОИЗВОДНЫе борНЫХ КИСЛОТ, В ТОМ ЧИСЛе ПеПТИДИЛбОрНЫе КИСЛОТЫ (2848-

262

Глава пятая. Регуляция и влияние внешних факторов

2853J - Эти соединения ингибируют не только сериновые протеазы, но и лакта-мазы [2854,28551, аминопептидазы [28561 и некоторые эстеразы [2857,28581.

В то время, как производные борных кислот - аналоги неспецифических субстратов сериновых протеаз - довольно слабые ингибиторы (табл.65), шптидил-борные кислоты ингибируют в наномолярных концентрациях.

Рис.87. Стереопара участка активного центра субтилизина BPN' в комплексе с фенилборной кислотой (выделена сплошной линией) [2875]

Алкилборные кислоты, как это подтверждается данными рентгеноструктурных исследований' (2874-2877] и исследованием 11В-ЯМР спектров (2878] образуют с сериновыми протеазами комплекс, сходный по строению с тетраэдрическим промежуточным соединением (рис.87).

Таким образом, комплексы этих ингибиторов (XXIV) действительно напоминают по структуре переходное состояние, или тетраэдрическое промежуточное соединение (XXIII):

ОН

XXIII

HN-

R-Е-

I

XXIV

он

-в—он

14

HN--U

гш

XXV

Однако, по данным 15N-HMP, фенилборная кислота образует ковалентную связь не с серином, а с гистидином активного центра а-литической протеазы (XXV) (28791. По-видимому, такое строение характерно для комплексов с аналогами неспецифических субстратов.

Связывание алкилборных кислот с ферментами сопровождается конформацион-ш

страница 40
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Химия протеолиза" (8.49Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
остатки плитки распродажа москва
Royal London 40090-01
тумба под телевизор поворотная
курсы массажистов с дипломом

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(03.12.2016)