химический каталог




Химия протеолиза

Автор В.К.Антонов

лоидметилкетонами -идет, по-видимому, через образование гемикеталя с сериновым гидроксилом фермента и с последующим внутримолекулярным алкилированием остатка гистидина [2665,2666].

Следует отметить, что хлорметилкетоны реагируют и с тиоловыми группами [2667] и поэтому способны инактивировать цистеиновые амидгидролазы. Следовательно, использование их как единственных группоспецифических ингибиторов не дает однозначных сведений о природе модифицированного фермента.

Фторметилкетоны медленнее реагируют с сериновыми и цистеиновыми протеазами, чем соответствующие хлорметилкетоны [2668,2669]. Фторкетоны быстрее, чем хлоркетоны образуют гидратную форму, но медленнее реагируют с группами активного центра [2670]. По-видимому, эти ингибиторы связываются с ферментом в кето-, а не в гидратной форме и лишь в активном центре происходит образование полукеталя.

Эффективными ингибиторами сериновых протеаз являются а-бромацетамиды, производные ароматических аминов [26711- Так, бромацетилизоиндолин реагирует с метионином активного центра химотрипсина с константой скорости второго порядка й(/й4=147 М~1мин~1.

Предложены также сульфонаты типа [2672]:

R-CH(СООСН3)NHCOS03,

реагирующие с сериновыми протеиназами с отщеплением бисульфита, и алкинило-вые эфиры ароматических кислот [26731:

R-CtH„COOC=CCH^.

В качестве специфического необратимого ингибитора fi-лактамазы предложен [26741 фенилпропиналь, реагирующий с остатками аргинина и лизина:

Цистеиновые амидгидролазы. Кроме хлорметилкетонов, производных аминокислот и пептидов, с SH-группой многих цистеиновых амидгидролаз реагируют диа-

250

Глава пятая. Регуляция и влияние внешних факторов

зометилкетоны типа [2675-2677]:

C,HcCH„0C0NHCHC0CH-N-N.

В отличие от хлоркетонов, скорость реакции которых с SH-группой увеличивается с увеличением рН, диазометилкетоны наиболее эффективно реагируют при низких значениях рН. Отсюда был сделан вывод [26751, что эти реагенты атакуют незаряженную сульфгидрильную группу. Однако затем было показано [26781, что наблюдаемая рН-зависимость реакции может быть объяснена лимитирующим скорость протонированием промежуточного тиогемиацеталя (VIII) с последующей трехцентровой перегруппировкой:

О О R-й—CH=N

=N

R—C—CH==N=N R—С— CH ,—N=N R-C-CH,

¦ y^J Y 2 ,2

ImH+ I

ImH*

i

+ N2 Im

VIII

Реакция диазометилкетонов с цистеиновыми амидгидролазами происходит по схеме (34) (см. разд. 5.9.1) весьма эффективно. Так, константа скорости второго порядка реакции катепсина В с ZPheAlaCHN2 й(/К4=7,5.104 М_1мин-1 [2679], а с ZPheTrpCHN2 - 8.-5.106 М-1мшГ1 (26801. Эти соединения не реагируют с низкомолекулярными тиолами.

К группоспецифическим ингибиторам тиоловых протеаз можно отнести 1,3-ди-бромацетон, реагирующий одновременно с SH-группой и остатком гистидина активного центра [ 26811:

— s

Вг

сн,

с = о-

сн2 /

Вг

-сн.» сн

N

-n)

\

с=о

1~-1

Известен и ряд других специфических необратимых ингибиторов цистеиновых протеаз 12682-26841. Среди них особой эффективностью обладает соединение <1Х), реагирующее с катепсином В с константой скорости fet/#t=2,6.106 М 126821:

рз°

ZPheSer(0Ben)CH20C0-^O) ¦

IX

р3с

Аспартатные амидгидролазы. В 1965 г. было обнаружено [13401, что дифе-нилдиазометан этерифицирует 2-3 карбоксильные группы пепсина с частичной потерей каталитической активности фермента. Поиск более специфических ди-

5.9. Ингибиторы

251

азосоединений привел к получению большого числа реагентов, специфически ин-гибирующих аспартатные протеазы путем реакции с каталитически важной карбоксильной группой (Asp215 у пепсина) (1341-1343,2685-2688). Наиболее известным из них является метиловый эфир диазоацетилнорлейцина:

N-N-СНСОШСНСООСН,

(сн2)3сн3

Соединения этого типа реагируют с протеазами в присутствии ионов Cu2+. Механизм реакции, по-видимому, заключается в образовании сначала комплекса карбена с ионом меди [1343,2689):

О

r-C-CBX, + CuCl2 -» pJ

О

RCCH-Cu

¦С12 + N2.

Поскольку карбеновый комплекс несет положительный заряд, вероятно, он связывается с ионизированной карбоксильной группой. Исследование рН-зависи-мости инактивации [1342,1343) указывает на участие протонированной группы с рйа»5. Таким образом, реакция идет, по-видимомус протонированной СО0Н-группой остатка Asp215 при участии соседней ионизированной карбоксильной группы. Ни денатурированный пепсин, ни пепсиногены не реагируют с диазосое-динениями [1341,2685). Диазосоединения были использованы для введения ЭПР-метки в активный центр аспартатных протеаз [2690).

Другими группоспецифическими реагентами для аспартатных протеаз являются эпоксиды типа 1,2-эпокси-3-(п-нитрофенокси)-пропана [2691):

о

2"

В кислой среде эпоксиды реагируют с карбоксилатными группами [2692). Было показано [2693), что этот реагент образует сложноэфирную связь с остатком Asp32 в пепсине. Кроме того, в определенных условиях затрагивается группа Asp215 и остаток Met180.

Рентгеноструктурные исследования пенициллопепсина, ингибированного эпок-сисоединениями, показали [1345), что карбоксилат-ион Asp32 атакует атом С-1 эпоксида, тогда как реакция с Asp215 идет по атому С-2.

Металлсодержащие амидгидролазы.. Для этой группы ферментов наиболее специфическими реагентами являются хелатирующие вещества (этилендиаминтетраук-сусная кислота, 1,10-фенантролин), связывающие ион металла (см. разд. 5.9.2). Кроме того, весьма специфически реагируют обратимые ингибиторы, описанные в разд.5.9.3. Группоспецифические необратимые ингибиторы для этих ферментов в настоящее время отсутствуют. Имеются лишь сообщения- о действии некоторых ингибиторов на отдельных представителей металлсодержащих амидгидролаз. Так, описано (2694) действие хлорацетилгидроксамата метилового эфира лейцина и соответствующего нитрила на термолизин:

252

Глава пятая. Регуляция и влияние внешних факторов

ОН он

CICILCoJtCHCOOCH,, ClCH^Col-CHCN.

I I

сн2сн(сн3)2 сн2сн(сн3)2

Действие этих соединений основано, по-видимому, на образовании хелата с ионами Zn2+ и на этерификации остатка G1U143 в термолизине С26951.

Галоидкетоны - производные незащищенного лейцина - действуют на лейцин-аминопептидазу как обратимые ингибиторы С2696].

5.9.5. "Синкаталитические" ингибиторы

Некоторые субстраты и субстратоподобные соединения реагируют с амидгидролазами так, что подвергаются гидролитическому расщеплению и одновременно ин-активируют фермент. Такие соединения можно назвать "синкаталитическими" ингибиторами. Их также называют "субстратами-самоубийцами" ("suicide-substrates").

Примером таких соединений являютя 5-ацилоксиоксазолы (26971:

с1 А ,ОСОСНМе,

3 X: R=Ph,

юг

R2= (CH2)3NHC(=NHN02)NH2;

.R2 XI: R1=Ph, R2=Me

При взаимодействии с тромбином, химотрипсином или трипсином (но не плаз-мином) эти соединения ацилируют каталитически активный остаток серина с образованием устойчивого пивалоил-фермента:

Е-ОН +

N-

о1 .0 ОСОСНМе, Ri .0. п _, Е-0С0СНМе3 +

-R2

R2

Ацилирование тромбина соединением XI идет с константой скорости ft{/K{= 2,6.10д М~1мшГ1.

Другой, но близкий тип соединений, ингибирующих эластазу, химотрипсин, трипсин и катепсин G, - это соединения (XII) и (XIII) (26981:

^А ч "

оАо

XII хш

Действие их также основано на реакции ацилирования фермента. Аналогичный механизм инактивации постулирован в отношении бензоксазинонов (XIV) (26991,

5.9. Ингибиторы

253

замещенных пиронов (XV) (2700), изокумаринов (XVI) (2701) и эноллактонов (XVII) (2702). Скорость деацилирования трипсина, ацилированного соединением (XVI) (X=Y=H, Н=(СН2)31Шз), составляет всего лишь 5.3.10"4 с-1. Рентгено-структурный анализ комплекса соединения (XV) с химотрипсином показывает (2700), что ингибитор образует солевую связь с имидазолом His57 и, по-видимому, препятствует подходу молекулы воды на стадии деацилирования.

Y

XIV XV XVI XVII

Эластаза эффективно реагирует с карбаматами типа XVIII (2703) через промежуточное соединение (XIX):

+

-Im

HNR

I /=Р

—ОН

-N

—ImH R I

N

— О

н

— ImH

С

С —NHR

II О

XVIII XIX

Инактивация некоторыми "синкаталитическими" ингибиторами, например, га-лоидэноллактамами (2704), связана с образованием ковалентной связи с каким-нибудь нуклеофилом фермента, происходящим на стадии промежуточного ацилфер-мента.

Еще один тип ингибиторов основан на промежуточном образовании карбоние-вых ионов (2705):

-NO

+ Е —ОН

"Ж"

о

С—ОЕ

СН„

Ж:

с —ОН

СН2—Е

XX

Соединение XX (В=0Ме) ингибирует химотрипсин на 98% за 5 мин.

Нитрилы типа (XXI) инактивируют карбоксипептидазу А через стадию промежуточного образования кетимина (XXII) (2706):

HN

Н Н

XXI

XXII

254

Глава пятая. Регуляция и влияние внешних факторов

К "синкаталитическим" ингибиторам принадлежат и многие антибиотики пени-циллиновой группы, инактивирующие D-аланинкарбоксипептидазы и р-лвктамазы за счет ацилирования каталитически активного остатка серина р-лактамной карбонильной группой [256,263,27071.

Показано [27081, кроме того, что 6-р-бромпенициллановая кислота инакти-вирует р-лактамазу I, образуя ацильное производное фермента

Наконец, возможно, что к "синкаталитическим" ингибиторам амидазы из Pseudomonas aeruginosa относится мочевина, оксимочевина и цианат, необратимо инактивирующие этот фермент за счет реакции по активному центру (2Ю31.

5.9.6. Природные ингибиторы

Существуют два типа природных ингибиторов амидгидролаз: низкомолекулярные, микробные ингибиторы (см. обзоры: (2709,27101) и белковые ингибиторы животного или растительного происхождения [2711-2714].

Никробние ингибиторы, продуцируются различными штаммами Aspergillus. Эти соединения очень эффективно и специфично ингибируют протеазы различных классов так, что они могут быть отнесены к ряду группоспецифических ингибиторов. Эти соединения содержат весьма необычные производные аминокислот:

NHpCHCH(0H)CHpC00H NHpCHCH(0H)C00H

н+

статин [S,S1 (Sta)

десметиленстатин (fl.Sl (Dst)

4-фенил-3-амино-2--оксимасляная кислота IR.S] (Pab)

а- (2-иминогекса: 4-пиримидил1-глицин

Н

cs;s] (Pgi)

HOOCCHNHCOOH

N-карбокси-фенилаланин IS] (Cph)

5-(формилоксиамино)-2 амино-валериановая кислота (oav)

В табл.63 приведена эффективность таких ингибиторов в отношении амидгидролаз различных групп [2709,2710,2715-27221.

5.9. Ингибиторы

255

Таблица 63. Микробные ингибиторы амидгидролаз

Название * Структура Ингибируемый фермент й{, нМ или(1__ мкг/мл) ОО

Лейпептин RCOLeuLeuArgH Трипсин Плазмин Катепсин В Акрозин Папаин 130 (100) (0,44) 70 (0,08)

Антипаин NCph-ArgLeuArgH Трипсин Катепсин А Катепсин В Плазмин Папаин (0,26) (1,2) (0,6) (93) (0,16)

Химостатин NCph-Pgl-XaaPheH Xaa=Leu(A),lie(В),Val(C) Химотрипсин Катепсин А Катепсин В Катепсин D Папаин (0,15) (62,5) (2,6) (49) (7,5)

Эластатиналь NCle-Pgl-GlnAlaH Эластаза 240

Пепстатин RCOValStaAlaStaOH (R=i-Pr,Ac,Lac) Пепсин Катепсин D Ренин Гастриксин Протеаза ВМЧ-1 1 10 0,13 100 20

Е-64 Ерв-LeuAbg Катепсин D (240)

Е-б4с Ерв-beuDmpa Катепсин Ъ (110)

Лохистатин FtO-Eps-beuDmpa Папаин -

Бестатин Pab-LeuOH Аминопепти-даза В Лейцинамино-пептидаза (160) (32)

Фосфоамидон 6-dMan-PLeuTrpOH Термолизин 28

Амастатин Dst-ValValAspOH Аминопепти-даза А (0,54)

Арфаменин * [Arg-CHgCH (CH2C6H40H )COOH Лейцинамино-пептидаза Аминопепти-даза В Карбоксипептидаза А (0,5) (0,002) (5,2)

Фороксимитин Oav-Ser-dlcOav Дипептидил-карбоксипеп-тидаза (7,0)

*Сокращения см. выше, а также: ArgH - аргиналь; NCph - в образовании амидной связи участвует HNCOOH группа; PheH - фенилаланиналь; NCle - №-карбокси-[5]-лейцин; AlaH - аланиналь; Ерв - епоксиянтарная кислота; Abg - 4-гуанидино-1-аминобутан; Dmpa - 3,З-Диметил-1--аминопропан; 6-dMan - 6-дезоксиманнопиранозил-1-фосфат; dkOav - дикетопиперазин Oav. ¦ • | Для ряда микробных ингибиторов амидгидролаз проведены интересные структурно-функциональные исследования. Так, было изучено действие различных аналогов и производных пепстатина [2723V2727]. Оказалось, что этерификация

256

Глава пятая. Регуляция и влияние внешних факторов

С-концевой группы не влияет на его ингибиторные свойства. Однако ацетилиро-вание или удаление 6-оксигруппы в остатке аминокислоты статина снижает активность примерно в 1000 раз (27241. Некоторые фрагменты пепстатина - все еще весьма сильные ингибиторы (К{<«3.10""6 М) (27251. Предполагается, что ин-гибиторная активность пепстатина обусловлена сходством его структуры со структурой переходного состояния в реакциях, катализируемых аспартатными протеазами (об аналогах переходных состояний см. разд.5.9.7) [2725]. Сходные представления существуют в отношении фосфоамидона (27281. Пепстатины, отличающиеся ацильной группой (В=изо-валерил, ацетил, лактил), по-разному ингибируют аспартатные протеиназы (27291. Так, протеаза вируса ВМЧ-1 слабо подавляется изовалерилпепстатином (Я{»1.10-4 М) (27301, тогда как ацетил-пепстатин весьма эффективен (ift»20 нМ при рН.4,7) (27311- (27311-

Различные производные эпоксидного ингибитора цистеиновых протеаз Е-64 были исследованы (2720,2732-27351 в отношении скорости ингибирования папаина и катепсинов В и Н. Последний реагирует с Е-64 существенно медленнее, чем первые два фермента. Исследование различных стереоизомеров и аналогов бестатина (2717,2736,27371 показало важность конфигурации атома С-3 в остатке 3-амино-2-окси-4-фенилмасляной кислоты. Конфигурация остальных асимметрических атомов бестатина мало сказывается на активности.

Из культуры Stachybotlys complement I был выделен интересный ингибитор (К-67) (2738,27391, подавляющий систему комплемента на стадии активации СБ-фактора:

К-76

Следует отметить случаи нечувствительности некоторых протеаз к группоспеци-фическим микробным ингибиторам. Так, протеазы Scytalldlum llgntcolum и протеиназа А из Aspergillus nlger, по всем своим свойствам являющиеся аспартатными амидгидролазами, нечувствительны к пепстатину (909,27401. Кроме того, отмечен случай инверсии свойств лейпептина в отношении подавления активности катепсина В при переходе от опытов In vitro к опытам на животных. В последнем случае лейпептин оказался эффективным стимулятором катепсина В (27411.

Белковые ингибиторы. Биологические жидкости и ткани животных и растений содержат большое число ингибиторов протеаз. Это белки или гликопротеины с молекулярной массой от 3000 до 700 ООО. Однако большая часть хорошо изученных в настоящее время белковых ингибиторов содержит 60-70 аминокислотных остатков. Число известных сейчас ингибиторов очень велико. Сведения о многих ИЗ НИХ МОЖНО наЙТИ В Обзорах (2711-2714,2742-27581.

Наряду с ингибиторами широкого спектра действия, такими, как ^-макро-глобулин (27591, большая часть ингибиторов проявляет определенную групповую специфичность.

Особенно распространены ингибиторы сериновых протеиназ. Их предложено

5.9. Ингибиторы

257

классифицировать, как минимум, на 10 семейств [27491. Сюда входят ингибиторы семе

страница 39
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Химия протеолиза" (8.49Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
шелест курсы бухгалтера
антистрессовые картины
учеба на косметолога подольск
учиться на косметолога в королеве

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(03.12.2016)