химический каталог




Химия протеолиза

Автор В.К.Антонов

[2560]

Тионин •1 45¦10-5 625 [2560]

и 3,4-Ю-5 622 [2562]

Акрифлавин н Пепсин н б-Ю"4; "i ,2.ю-4 476 [2563]

Бриллиантовый зеленый Химотрипсин - 420; 625 [2564]

Родамин 6G II 0,8-Ю"5 542 [25653

Пурпурный Бибериха II - 420; 625 [2566]

Неспецифическому ингибированию подвержены не только сериновые протеазы, но и представители всех других групп амидгидролаз. Так, диоксан [23363, спирты (25693, фенолы и другие ароматические и циклоалифатические соединения ингибируют активность пепсина. Спирты подавляют активность лейцинаминопептидазы (2570), причем их эффективность коррелирует с длиной алифатической цепи.

Хелатирующие агенты также можно рассматривать как неспецифические инги-

5.9. Ингибиторы

243

биторы металлсодержащих амидгидролаз, поскольку их ингибирующая способность определяется общим для них свойством связывать ионы тяжелых металлов [2389, 2486,25711.

Одновалентные катионы в ряде случаев способны подавлять активность протеолитических ферментов. Так, отмечено подавление активности гландулярного калликреина ионами Na+ и К+ в физиологических концентрациях [2572], а также ингибирование этими ионами активности мультикаталитических протеиназ (про-теосом) [2573].

Тип ингибирования зависит не только от структуры ингибитора, но иногда и от структуры субстрата. В качестве примера можно отметить [2574], что ингибирование пепсина этанолом носит чисто конкурентный характер в отношении гидролиза ZPhe(N02)А1аАрт и чисто неконкурентный характер в отношении гидролиза ZAlaPhe(N02)Apm.

Связывание ингибиторов во многих случаях приводит к конформационным перестройкам в белке, что проявляется в изменениях их спектральных и других физико-химических свойств [1375], в изменении рЯа ионогенных групп, сопровождающемся связыванием или отщеплением протона [2575-25771, а также в большей устойчивости комплексов ферментов с некоторыми ингибиторами к денатурации по сравнению со свободными белками [2578,25791.

Связывание ингибиторов зависит также от олигомерного состояния фермента [25801.

5.9.3. Специфические обратимые ингибиторы

К зтому типу ингибиторов можно отнести субстраты, продукты ферментативной реакции и их аналоги.

Ингибирование субстратами подробно исследовано на примере карбоксипептидазы А [1738,2581-25831. Кинетическая схема катализа этим ферментом описывается схемой (37), а скорость реакции - уравнением (38) (см. разд.4.1.6).

При низких концентрациях субстрата реакция подчиняется кинетике Михаэли-са-Ментен. При увеличении [S1Q с ферментом связывается вторая молекула субстрата, активируя процесс гидролиза (f3>1), и, наконец, дальнейшее увеличение концентрации субстрата приводит к связыванию третьей молекулы, которая ингибирует фермент. Значение р для разных субстратов варьирует в пределах от 2 до 4,5, а величины К'в примерно на порядок выше значений Кд. Ингибирование характеризуется константой ЯЦ порядка 17-30 мМ, за исключением ZGlyPhe, для которого Я?=0,3 М [1738]. Интересно отметить, что ацетилирова-ние карбоксипептидазы N-ацетилимидазолом лишает фермент способности ингиби-роваться субстратом [2584].

Продукты гидролиза, как правило, ингибируют ферменты. Анализ типа ингибирования продуктом позволяет сделать важные выводы о механизме ферментативной реакции (2585). Однако на этом пути встречаются довольно большие сложности. Так, было показано [2175,2585,2586], что при гидролизе соединений типа AcPhePheOMe, катализируемом пепсином, ацильный фрагмент (AcPheOH) проявляет свойства неконкурентного ингибитора, тогда как второй продукт (HPheOMe) является конкурентным ингибитором (при рН 2). Отсюда был сделан вывод об упорядоченном отщеплении продуктов из комплекса с ферментом 16*

244

Глава пятая. Регуляция и влияние внешних факторов

Е + s «—» ES-> EPQ-> ЕР -> Е + Р

+ Q

(где Р=НРпе0Ме и Q=AcPheOH) и о существовании промежуточного аминофермента, которому приписывалась ковалентная природа. При рН<»4 наблюдается конкурентное ингибирование ацетилфенилаланином, что указывало на неупорядоченный механизм при повышении рН:

|-* ЕР-> Е + Р

Е + s ^—». ES-» EPQ

I-* EQ-» Е + Q

Противоположные результаты были получены (2587 3 по ингибированию ацетилфенилаланином катализируемого пепсином гидролиза AcPheTyr в области рН 2*4,5. На основании полученных данных постулировался упорядоченный механизм при низких рН и переход к неупорядоченному по мере ионизации группы с рКа«3.

Наконец, было показано (25883, что различия в типе ингибирования могут возникать, если ингибитор связывается не только со свободным ферментом, но и с фермент-субстратным комплексом. Таким образом, по крайней мере, в случае пепсина, результаты ингибирования продуктом не позволяют ответить на вопрос об упорядоченности механизма гидролиза.

Весьма эффективные ингибиторы получаются, если объединить в одной структуре оба продукта ферментативного гидролиза (так называемые bi-proauct analogues). Например, 1-бензилсукцинат (I) ингибирует карбоксипептидазу с К(=0,45 мкМ (2589), частично воспроизводя структуру гиппуровой кислоты и фенилаланина:

PhCHgCHNHg сн2соон СООН СО

Jib

H-i СООН

СбН5

PhCH2CH-CH2C00H

Соединения (II) и (III) оказались чрезвычайно эффективными ингибиторами карбоксипептидаз В и N соответственно (2590,2591):

H?N

2 yCr-Ш(СН_)^S-CH-COOH К =4 МКМ,

HN^ ' 1

CH„-I

2 СООН

II

С-МН(CHg)2S-CH^CH-COOH

й4=0,002 мкМ.

Ill

ch2sh

5.9. Ингибиторы

245

Сходного типа ингибиторы были предложены [2592 3 для ряда сериновых протеаз группы трипсина (плазмин, калликреин, тромбин и др.), а также для некоторых металлсодержащих протеаз [2593,25943.

Очень большое число работ посвящено исследованию ингибирующего действия аналогов субстратов. Сравнение констант ингибирования химотрипсина амидами и эфирами ацетил-1>-аминокислот показало очень небольшие отличия в К( амидов и эфиров, тогда как соответствующих субстратов различаются весьма значительно, причем Kt и /Г амидов весьма близки [16663. В случае эфиров между К. и К* наблюдается заметное отличие. Отсюда следует, что К' амидов совпа-

t m m

дает с Кд - константой диссоциации комплекса Михаэлиса. В случае же эфиров - эффективная константа. Равенство и Кд имеет место и при пепсиновом катализе [2338,2444,25953. В случае пепсина К( лишь нейтральных ингибиторов не зависит от рН [23383, однако, например, в термолизине такой зависимости нет и для заряженных субстратов [25963.

В большинстве случаев ингибирующая способность аналогов субстратов протеаз определяется не только первичной, но в значительной мере и вторичной специфичностью, т.е. структурой групп, удаленных от расщепляемой в соответствующем субстрате связи [2597-2602 3. В этом отношении интересным примером является ингибирование катепсина D и пепсина пептидами, содержащими обычно расщепляемую этими ферментами связь PhePhe (табл.61).

Таблица 61. Ингибирование катепсина D и пепсина [2601]

Ингибитор Kt, мкМ Катепсин D Пепсин

pGlu-D-PheProPheFheVal-D-beu D-FheFroPhePheVal-D-beu D-FhePro-D-Phe-D-PheVal-D-Leu B-PheProPhePheVal 0,031 0,52 650 He ингу 0,47 5,2 [бирует

Как видно, наиболее эффективно ингибирующее действие проявляется при I-1-конфигурации аминокислот, образующих потенциально расщепляемую связь, тогда как D-D-знантиомер ингибирует катепсин D примерно в «103 хуже.

Однако в случае а-химотрипсина структура и конфигурация вторичных аминокислотных остатков вносят незначительные изменения в константу ингибирования [2597,25993- Был отмечен различный тип ингибирования гидролиза химотрипсином n-нитроанилида сукцинилфенилаланина и трипептидного субстрата ValTyrGly ингибитором GlyTyr-I>-Ala (2597 3.

Влияние вторичных взаимодействий прослеживается и на сериях весьма сходных ингибиторов термолизина (26033:

^^^-CHgCHgCONHCHCOOH, <^ОУ-сн2осошснсоон,

R R IV V

246

Глава пятая. Регуляция и влияние внешних факторов

где R=H, СН3. СН(СН3)2. СН2СН(Ш3)2. СН(СН3)СН2СН3.

Если значения К( соединений IV коррелируют с гидрофоОностью группы R (lgKt=-0,73711-1,8), то для ингибиторов типа V наблюдается корреляция не с гидрофобностью, а со стерическими эффектами этой группы (lgKt = 0,88Es -3,086). По-видимому, эти соединения, отличающиеся лишь заменой группы QH2 на о-атом, по-разному связываются в активном центре фермента. Замена NH-группы в Р1-остатке субстратов пепсина на атом кислорода [1990] или замена СО-группы на СН2-группу в Р^-остатке таких субстратов [26043 превращает их в конкурентные ингибиторы ферментов, причем значения К( оказывается весьма близкими значениям К'.

т

Очень сходные ферменты также могут проявлять совершенно разную чувствительность по отношению к ингибиторам. Так, j«-CP3C6H4C0AlaAla-n-NA ингибиру-ет эластазу лейкоцитов с Kt=4-10~6 М, но не действует на панкреатическую эластазу [26053.

Большую группу весьма эффективных ингибиторов сериновых протеаз составляют фторированные пептидкетоны [2606-26083 типа:

Acyl-HH-CH-CONH-CH-COCP2X,

If А-

где R1 и R2 - остатки специфических для положений и Б2-связываюших

участков фермента аминокислот, а X - атом фтора или цепь, специфичная в отношении S*-связывающих участков. Большинство таких ингибиторов медленно, но

очень прочно (К4»1-10-9 М) связывается в активном центре, образуя с серино-вым гидроксилом полукетали:

R

Е-0—

-СР3, О"

т.е. сходны с так называемыми аналогами переходного состояния (см. разд. 5.9.7). Аналогичного типа ингибиторы были предложены для аспартатной протеазы.ренина (2609).

Такими же "псевдонеобратимыми" ингибиторами цистеиновых протеаз являются пептидонитрилы, например AcPheLeuC=N (Kt=5,8.10~6 М), образующие с SH-груп-пой фермента промежуточные соединения типа R-C(-NH)-S-E (26103.

Обратимые ингибиторы ренина и других аспартатных протеаз на основе восстановленных по расщепляемой группе субстратов (VI) и (VII) также оказались весьма эффективными [2611-2614З:

R-CH„NrI-R' и R-CHCH^NH-R'.

VI VII

Сходного типа ингибиторы подавляют активность коллагеназы и некоторых

5.9. Ингибиторы

247

металлсодержащих протеиназ [2615-2617 3-

Выдающейся эффективностью (й(<«7-10_11 М) обладают аналоги субстратов аспартатных протеаз на основе фосфиновых кислот [26183, например:

IvaVal-NHCH-P-CH2C0-AlaXaa.

На основе данных о строении некоторых протеаз удалось разработать весьма эффективные ингибиторы металлсодержащих ферментов. Их действие основано на введении в молекулу группировки, образующей координационную связь с атомом металла [2&19-2631З. Среди них наиболее эффективными и широко используемыми являются каптоприл (VIII) и тиорфан (IX):

HSCH2CHC0-n

hsch2chconhch2cooh.

сн с И

ООН 265

VIII 1Х

Каптоприл используется для подавления дипептидилкарбоксипептидазы (ангио-тензинпревращающего фермента) In vivo. Этот же фермент подавляется с К(= 4,5.Ю-12 М аналогом субстрата - [дез-Рго33-брадикинином (26323.

Специфические субстратоподобные ингибиторы, содержащие в своем составе группировку красителя (дансильную, акридиновую и др.), широко используются для введения обратимых репортерных групп в амидгидролазы [1881,2633-26353.

5.9.4. Необратимые группоспецифические ингибиторы

С представителями этой группы ингибиторов мы уже встречались (см. разд. 2.6). Здесь они будут рассмотрены несколько подробнее. Сведения о многих из них можно найти в обзорах [2545,2636-26383.

Серикобые алаЮгьЮролазы. Важнейшими группоспецифическими ингибиторами сериновых амидгидролаз являются производные фосфорной кислоты, некоторые хлорметилкетоны и сульфонилфториды.

Производные фосфорной кислоты общей формулы

Riy°

реагируют с сериновыми ферментами, фосфорилируя каталитически активный остаток серина (в химотрипсине Ser195). Наиболее известный ингибитор - это диизопропилфторфосфат (R1=R2=U30-Pr, X=F) [13083. Ранние работы по действию ингибиторов этого типа суммированы в обзоре [1753. В качестве группы X, кроме атома галлоида, может быть фосфоэфирная (2639,26403 или фосфотиоэфир-ная (26413 и другие [2642,26433 группы. Реакция диизопропилфторфосфата с химотрипсином происходит с константой скорости й=2,7-103 1Г1мшГ1. Трипсин

248

Глава пятая. Регуляция и влияние внешних факторов

реагирует с этим веществом заметно медленнее №=0,3-Ю3 М"1мин"1) [22843. Эти скорости на 4-5 порядков выше, чем скорость реакции с модельным соединением - N-ацетил-Ь-тирозинамидом. Для различных алкилфосфатов были найдены структурно-функциональные корреляции ингибирующих свойств [2644,26453. Фос-фоэфирная группа может быть удалена обработкой гидроксиламином и другими нуклеофильными агентами с частичным восстановлением активности фермента [2646,26473.

Остаток серина селективно реагирует также с фенилметансульфонилгалогени-дами [2648-26503 и дифенижарбамоилхлоридом [2651 3, однако не все сериновые амидгидролазы в одинаковой степени чувствительны к алкилфосфатам и к этим последним необратимым ингибиторам.

Весьма широко и подробно исследовано действие на сериновые амидгидролазы хлоркетонов - производных аминокислот и пептидов (табл.62; ранние работы см. в: (26523).

Хлоркетоны - производные аминокислот реагируют с атомом Ne2 каталитически активного остатка гистидина (His57 в химотрипсине) (2660,2661), хотя

Таблица 62. Константы скорости реакции хлоркетонов с амидгидролазами

Фермент Ингибитор M~1o-1 (схема 34) Литературный источник

Химотрипсин ZPheCH?Cl* 73 (pH 7,0) [2653]

и ZGlybeuPheCH2Cl 3,0 (pH 5,8) [2654]

Трипсин То вЪубСН^ С1* ?'° [2653]

it D-ValPheLysCH2Cl 1,08.10* [2655]

Эластаза панкреатическая То же ZPheCILjCl Suo(Ala)2ProValCH?Cl 0,05 73 [2653] [2654]

н Tfa(Ala)2AlaCH2Cl 60 [2656]

Эластаза лейкоцит арная MeOSuc(Ala)2ProValCH2Cl 922 [2654]

Катепсин G Плазмин ZGlyLeuPheCHgCl D-ValPheLyBCH2Cl 260 ** 2,38.10\ [26541 [2655]

Тромбин человека D-ValLeuIysCtLjCl 2.54-104 „** 117 ** [26551

Фактор Ха быка B-ValPheLyBCH2Cl [26551

Калликреин Поотпролиновая протеаза ProPheArgCHgCl ZGlyGlyProCH2Cl 7,48.10* 109 [2657] [26531

Энкефалиназа TyrGlyGlyPhebeuCH2 CI (16 нМ)*** [2658]

Химаза кожи человека ZPheCHgCl 18,3 [26591

*Не являютоя группоспепифическими ингибиторами; реагируют с с й{/Шо, равной 50 (ZPheCH2Cl) и 46 (ТовБувСН^С!) [2653] папаином

*# Значения в M-1c71

1С50 по сокращению гладкой мускулатуры (морские свинки).

5.9. Ингибиторы

249

имеются данные и об алкилировании других остатков, в частности Met192 [2662]. Эти реагенты являются удобным средством введения репортерных меток в активные центры сериновых протеаз [2663].

Реакция хлоркетонов с ферментами следует кинетической схеме (34) с образованием промежуточного фермент-ингибиторного комплекса (с модельным соединением ацетилгистидином хлоркетоны реагируют на «.6 порядков медленнее (26641).

Кроме хлоркетонов с ферментами этой группы реагируют другие производные пептидижетонов типа R-COCH?X (Х= СОСН3, ОСОСН3, Р и др.), причем эффективность ингибирования связана с индукционной постоянной группы X линейным соотношением [2665]:

-logK{ = 7,2о1 + 2,1.

Реакция с га

страница 38
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Химия протеолиза" (8.49Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
Le Creuset 20126006300460
электропривод воздушной заслонки siemens
аренда автобуса на сутки цена
Кукла Arias Т59291

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(25.05.2017)