химический каталог




Химия протеолиза

Автор В.К.Антонов

аммония (25101, а также полиэлектролиты (25111.

Объектами криоэнзимологических исследований были реакции, катализируемые

ХИМОТРИПСИНОМ [2512-25151, ТрИПСИНОМ [2516-25191, ПаПЭИНОМ [2520-25221,

карбоксипептидазой А [2508,2509,2523,25241, пепсином [2525], пенициллопеп-сином (25261, лейцинаминопептидазой [2527-25291 и 6-лактамазами [2510, 25301.

Оказалось, во-первых, что зависимости каталитических констант от температуры во многих случаях подчиняются уравнению Аррениуса вплоть до температур порядка -50*-60°С. Во-вторых, при низких температурах удается существенно замедлить отдельные стадии процесса и таким образом идентифицировать

236

Глава пятая. Регуляция и влияние внешних факторов

некоторые промежуточные соединения в катализе. Так, при рН 5,5 и -40°С в смеси диметилсульфоксид - вода (65:35) удается выделить ацилхимотрипсин, образующийся при гидролизе п-нитрофенилового эфира ацетилтриптофана (2512). В то же время в случае пепсина, пенициллопепсина или лейцинаминопептидазы обнаружить ковалентные промежуточные соединения не удалось [2525-2527]. Было сообщено [2524] о прямом доказательстве образования промежуточного ангидрида в ходе катализа карбоксипептидазой А при низких температурах. Вместе с тем спектральные исследования [2508,2509] свидетельствуют скорее об отсутствии такого промежуточного соединения, но дают четкие доказательства образования второго фермент-субстратного комплекса (см. гл.6). Такое же двухстадийное комплексообразование обнаружено в случае лейцинаминопептидазы [2528,2529], а для трипсина зафиксирована изомеризация в каталитически менее активную форму [2518], а не образование тетраэдрического промежуточного соединения, как это предполагалось ранее [2531].

Криоэнзимологическая техника начинает получать применение и в рентгено-структурном анализе (2532-2534), позволяя в принципе изучать структуру комплексов ферментов с истинными субстратами, а также в ЯМР [2535].

5.8. Мицеллярная энзимология

В последнее время появились новые интересные возможности изучения ферментативных реакций при низких температурах [2516,2536]. они заключаются в создании в органическом растворителе обращенных мицелл (рис.81). Это удается сделать, вводя в систему поверхностно-активное вещество, например, бис-(2-этилгексил)-сульфосукцинат натрия [2536] или лецитин [2537].

Рис.81. Схематическое изображение обращенной мицеллы поверхностно-активного вещества (ПАВ) в органическом растворителе (а) и фермента, включенного в мицеллу (б)

1- ионная (полярная); г- углеводородная группа в молекуле ПАВ; 3- противоионы или солюбилизирован-ные молекулы воды; 4- молекула фермента

Основные принципы мицеллярного катализа изложены в разд.3.4.9. Реакции в мицеллах широко используются при обычных температурах (см. обзор: [1631] и цит. лит.). Каталитическая активность в этих условиях зависит от соотношения вода/поверхностно-активное вещество, проходя через максимум. В максимуме создается оптимальное соотношение между диаметром внутренней полости и размером белковой молекулы. Эффективность катализа по сравнению с водными растворами сильнее снижается для более специфичных субстратов, чем для простых производных ациламинокислот [2538].

Достоинствами обращенных мицелл являются оптическая прозрачность растворов, их низкая вязкость и низкие температуры замерзания.

5.9. Ингибиторы

237

5.9. Ингибиторы

В этом разделе будет рассмотрено действие на амидгидролазы органических веществ, подавляющих каталитическую активность ферментов. Действие неорганических ионов было рассмотрено в разд.5.3.

5.9.1. Кинетика ингибирования

Все ингибиторы можно разделить на две большие группы - обратимые и необратимые. Первые обычно образуют с ферментом нековалентные связи, и их действие может быть обращено, например, разбавлением смеси или отделением ингибитора гель-фильтрацией. Вторые реагируют с ферментом, образуя ковалентные связи, и их действие такими простыми приемами обратить не удается. Известны, однако, случаи, когда вещество, связывающееся нековалентно, очень трудно отделить от белка и, наоборот, ковалентная связь разрушается достаточно легко.

Обратимый ингибитор может взаимодействовать как со свободным ферментом, так и с фермент-субстратным комплексом (см. обзоры: (1661,24251):

Ks \ Е + S ч-- ES-- Е + Р

ОК. (24)

акд \\ 1 №г

EI + S В » ESI -> EI + Р.

Общее выражение для скорости реакции, соответствующее кинетической схеме (24), будет:

аК, + 6(11

*U - (El (SI

2 аК. + (II ° °

t о

V = -. (25)

К. + (II t о

аК -+ (SI

s ccK. + (II

t о

Тип ингибирования определяется численными значениями коэффициентов а и |3 (25391.

Полное конкурентное гшгибирование характеризуется значениями а-»со, причем р не имеет физического смысла. В этом случае уравнение (25) трансформируется в:

ЙЛЕ1 (S1

2 о с

[11о

(1 + -) + [S1

(26)

Определение величины К( чаще всего проводят по методу Диксона [16611, строя зависимость 1/и от [11о при нескольких значениях [Slo, или же из зависимости I7m1/[S1 при нескольких значениях Шо (рис.82).

Полное неконкурентное ингибирование (а=1, р=0) описывается уравнением

238

Глава пятая. Регуляция и влияние внешних факторов

1 и Г и 1 1 и '

1 К / "Л у.

7 ~"т 0 1 S _! _2 о '/ Km Kl s Л -1 о s

1 а 6 в

Рис.82. Определение константы ингибирования методом Лайнуивера и Берка а- неконкурентное торможение; б- конкурентное торможение; 6- торможение смешанного типа

скорости:

fe„/(1 + [Ц /Я,)(Е1 (S1

2 о t о о

V = -. (27)

К + (S1

8 о

Значение й( находят теми же способами, что и в' случае конкурентного ингибирования.

Смешанное ингибирование (а и pV1). В этом случае координаты точек пересечения графиков 1/u-M/(Slo даются выражениями (25391, не зависящими от й{:

1 1 6-1

(28)

[S1 К а-В

О 8

1 1 а-1

v V a-f

max

(29)

Зная Кд и V ак из опыта в отсутствие ингибитора, можно найти а и 6, решая совместно уравнения (28) и (29).

Другой способ, позволяющий найти значения а, р и К(, заключается в преобразовании значений k , и К' в уравнении (25) к виду:

0*1 1 1

^at^V1) е-1 [I]o

1 0*1 1

+ -, (30)

+ -. (31 )

K'/(K -1) а-1 (II а-1

me о

Из этих двух графиков можно найти все три константы.

Ингибиробание субстратом было рассмотрено в разд.4.1.6.

Ингибиробание продуктом реакции анализируется обычно при больших степенях превращения субстрата, когда условие стационарности не соблюдается. Поэтому, для кинетической схемы

5.9. Ингибиторы

239

Е + S <*-- ES -> Е + Р, Е + Р -ЕР (32)

используют интегральное выражение для скорости: ГР1 V К (1 + (S) /г_) (S1

LP J max s о Т? о

- =----Ш-. (33)

t 1 - Ks/Kp t(1 - Я8/Кр) (Slo - (PI

Строя графики зависимости (P]/t от 1/t-ln(S]o/(S]o-(P] при разных (Slo и откладывая на вторичном графике обратные величины отсекаемых на оси абсцисс отрезков от (S)o, можно определить величину Кр. Часто ингибирование продуктом изучают как обычное обратимое ингибирование, вводя в реакционную смесь различные количества продукта и измеряя начальные скорости реакции. Анализ схем ингибирования для многосубстратных реакций дан в работе (2540).

В тех случаях, когда сродство ингибитора к ферменту очень велико, используемые в опытах по определению К( концентрации фермента и ингибитора оказываются сравнимыми, и допущение, лежащее в основе выводов выражений для ингибирования о постоянстве концентрации ингибитора ((1]»(Е1]), неприменимо. В этом случае для неконкурентного торможения можно определить величину й( из уравнения (2541):

(i) .

о 1

- = К, — + (Е1 ,

1-а * а °

где а = т.е. отношение скорости в присутствии ингибитора к скорости в

его отсутствие. Наклон графика в координатах (IWI-a от 1/а будет равен К(. Известны и другие типы анализа таких систем (2425, с.80; 2542).

Сложные случаи смешанных типов ингибирования предложено (2543) анализировать методом векторной Я^-У^^-системы координат. В этом случае строят зависимости кажущихся значений Я/ и для разных концентраций ингибитора и по положению и величине получающейся прямой (вектора) судят о типе ингибирования. Этот же метод можно использовать для исследования активации ферментов.

Часто бывает полезно проанализировать взаимные отношения двух ингибиторов одного и того же фермента. Два ингибитора будут взаимонезависимыми, если они могут одновременно связываться с активным центром фермента. Взаимозависимые ингибиторы вытесняют один другого (2544). Различать эти типы ингибирования можно, строя графики от (11)0 при постоянной концентрации второго ингибитора (рис.83). Для случая взаимозависимого ингибирования

(IJ

2 о 1 о

v/vt = 1 +

(я()2 (Kt)l

а для взаимонезависимых ингибиторов

[ij [1-1

1 о 2 о

V/V, = (1 + -)(1 + -).

240

Глава пятая. Регуляция и влияние внешних факторов

1

'Ы = consi [1г] = const

Рис.83. Определение взаимной зависимости действия двух ингибиторов на ферментативную реакцию

1- отсутствие второго ингибитора;

2- взаимозависимое и

3- взаимонезависимое действие второго ингибитора

Необратимое ингибиробание. Необходимо различать два типа необратимых ингибиторов: не обладающие сродством к ферменту и обладающие сродством (аффинные) ингибиторы. В первом случае реакция ингибитора с ферментом описывается как реакция второго порядка или, если ингибитор берется в большом избытке, как реакция псевдопервого порядка (см. обзор: (25451).

В случае аффинных ингибиторов последний сначала образует комплекс с ферментом, и затем фермент-ингибиторный комплекс превращается в необратимо ин-активированный фермент:

Е + I

EI

E-I.

(34)

В том случае, когда равновесие устанавливается быстрее, чем происходит химическая инактивация, скорость изменения активности фермента описывается уравнением (35), аналогичным уравнению Михаэлиса-Ментен:

„гтл k (El (II

dLiiJ toe

V =

at

K,+[I1 t с

(35)

Определить &(и K( можно, измерив начальные скорости инактивации при различных концентрациях (II и строя график 1/й„,„„ от- 1/(11 , где й_„„„ = &([11о/К{+[1]о (25461. Анализ теории и методов определения констант скорости необратимого ингибирования дан в работах (2547,25481.

Предложено также несколько способов определения числа функционально важных остатков фермента из данных по их химической модификации (2549-25511. Так, согласно (25501, доля остаточной активности фермента (а) и число важных для активности остатков (t) связаны выражением:

... N ¦ N -(Р + S)

а = Г*--^-•

Р Р

где N - общее число остатков данного типа в белке, Р - число медленно модифицируемых остатков, среди которых I остатков важны для активности, и S -число быстро модифицируемых остатков, несущественных для активности.

5.9.2. Неспецифические ингибиторы

Большую группу органических соединений, подавляющих активность амидгидролаз, можно назвать неспецифическими ингибиторами, поскольку их строение су-

5.9. Ингибиторы

241

щественно отличается от строения субстратов, а их действие обусловлено некоторыми общими для них физико-химическими свойствами. Эти ингибиторы могут подавлять активность очень многих амидгидролаз, активные центры которых проявляют гидрофобные свойства или несут заряд. Как и многие другие пробле мы химии амидгидролаз, их ингибирование наиболее подробно изучено на примере сериновых протеаз - химотрипсина, трипсина, эластазы и др.

К неспецифическим ингибиторам можно в первую очередь отнести ароматические соединения, действие которых на химотрипсин было подробно исследовано еще в 1963 г. [25523. Было испытано 130 соединений, относящихся к производным бензола, пиридина, нафталина и др. Все эти соединения характеризуются константой ингибирования химотрипсинового катализа порядка 1 -10~2-1 - Ю-3 М. Связывание циклогексанола заметно слабее (К{=29 MM [25533) по сравнению с фенолом (К(=3,5 мМ [25543), что указывает на плоский характер связывающего участка фермента.

ккал/моль

Рис.84. Зависимость свободной энергии комплексообразования ароматических соединений с химотрипсином от площади их поверхности [2413,2555]

I- пентан; 2- бензол; 3- циклогексан; 4- толуол; 5- хлорбензол;

б- нитробензол; 7- етилбензол;

е- инден; 9- нафталин; 10- азулен;

II- антрацен

50 60 70 60 90 SfK Существует определенная зависимость между площадью поверхности ингибитора и прочностью образования фермент-субстратного комплекса (рис.84) (2413, 25553, однако важнейшую роль в связывании играет их гидрофобность (рис.85) (2554,25563. Полярные заместители в ароматических соединениях очень мало влияют на эффективность комплексообразования. По-видимому, фермент "экстрагирует" лишь гидрофобный остов молекулы, тогда как полярные участки остают-

4

к

I (К х)

Рис.85. Зависимость относительных констант ассоциации производных фенола (RC^H^OH) от гидрофобности заместителя

Заместитель (К): Н (1), 4-КН„ (2),

4-C0NH2 (3),

4-ОН

(4), 3-ОН (5),

3-ОМе (б), 4-Ме (7), З-Ме (в), 2-С1 2-Бг (10), 4-С1 (11), 4-Вг (12), 2.4-С1 (13), 2,4-Вг (14), fi-нафтол (15)

1.0

(9),

О

3 I, S

'"14

~\0 0 1,0 я ся гидратированными. Аналогичные зависимости наблюдаются для алифатических спиртов [2553,25563 и других соединений. Связывание спиртов характеризуется значительным положительным изменением энтропии системы [2556,2557 3.

Ферменты, в комплексообразовании с которыми важную роль играют электростатические взаимодействия, эффективно ингибируются органическими соединениями, содержащими заряженную группировку. Это видно, например, из данных по ингибированию такими соединениями трипсина и ряда трипсиноподобных протеаз [2558,25593 (табл.59).

242

Глава пятая. Регуляция и влияние внешних факторов

Таблица 59. Ингибирование трипсиноподобных ферментов амидонами [2558]

К , мкМ К., мкМ Фермент Фермент

Бенза-мидин 5-Амидино-индол Бенза-мидин 5-Амидино-индол

Трипсин быка 35,2 29,1 Калликреин 933 1,2

Тромбин быка 332 7,7 Акрозин 4,0 0,5

Тромбин человека 235 7,9 Плазмин 207 112

Фактор Ха

человека 182 5,45

Особую группу ингибиторов составляют некоторые красители, эффективно связывающиеся с рядом протеолитических ферментов (табл.60).

Особенностью этих соединений является значительное изменение спектров поглощения или флуоресценции при связывании с ферментом. Этот спектральный сдвиг трактовался [25673 как следствие изменения диэлектрической проницаемости среды при комплексообразовании красителя с белком, причем свойства активного центра химотрипсина в этом отношении близки к свойствам циклогек-сана. Однако спектральный сдвиг красителя, по-видимому, определяется не столько диэлектрической проницаемостью, сколько' показателем преломления среды [25683.

Таблица 60. Красители - ингибиторы протеаз

Краситель Фермент К шах комплекса Литературный источник

Профлавин Химотрипсин 2,5-Ю"5 465 [2560,2561]

Трипсин 3,4-Ю"5 469

страница 37
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Химия протеолиза" (8.49Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
akma 610 complex
матрас орматек оптима лайт боннель
бутылочки в ульяновске купить
скамья для торговых центров

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(26.05.2017)