химический каталог




Химия протеолиза

Автор В.К.Антонов

ний, получены в условиях, когда компоненты буфера (трис) сильно влияют на скорость деацилирования.

Следует отметить, что во многих экспериментах по температурной зависимости кинетических констант наблюдались изломы на графиках Аррениуса (1907, 2452,2457,2461,2462). Такие изломы могут быть обусловлены несколькими причинами [2463]: а) сменой определяющей скорость стадии; б) конформационными изменениями фермента; б) температурно-зависимыми изменениями дЯ или aS.

В первом случае, если реакция идет по обычной для сериновых и цистеиновых протеаз трехстадийной схеме

й1 . й2 й3

Е + S --» ES -> ЕА-> Е + Р_,

*-1

Р1

переход от определяющей скорость стадии ацилирования к определяющей скорость стадии деацилирования должен приводить к излому на графиках lnfc +1/Т, но график lnfecat/Km от 1/Г должен оставаться линейным. Во втором случае

й1 й2 й3 Е + S «-* ES *-» E*S -> Е + Р

*-1 Кг

230

Глава пятая. Регуляция и влияние внешних факторов

Таблица 56. Термодинамические параметры активации ферментативного гидролиза

Фермент Субстрат Кинетический параметр AH*, ккал/моль AS*, e.e. Литературный источник

а-Химотрип- CHoC00CcH,N0„-n о о А с. k2 20,5 +13,5 [2452]

син ft3 15,0 -18,0 [2452]

fe3 9,7* -15,9* [1987]

AcPheOMe *й 16,9 +11 ,7 [2453]

fe3 10,1 -14,8 [2453]

АсТгрОМе *3 12,3 -10,0 [24541

Pa-Im V* 7,8 - [2455]

V* 15,0 - [24551

19,4 -5,8 [2456]

Трипсин ToeArgOMe 5,4 -31,4 [24571

9,77 -17,2 [2458]

Эластаза CH„C00C,H.N0„-n 3 6 4. S 10,2 -16,1 [2459]

ZGlyONp 8,6 -9,98 [2459]

BocAlaONp 8,53 -7,49 [2459]

Субтилизин AcPheOMe 3,83 -23,9 [2019]

Пепсин ZPhe(N02)PheApm fe + cat .7,8 -39,3 [1907]

ZLeuValPhe(N02)- ft 3,4 -44,6 [19071

-AlaApm

Карбоксипеп- ZGlyGlyPhe cat 12,6 -6,7 [2327]

тидаза А ZGlyGlyVal ft + cat 15,1 0 [2327]

Термолизин FaGlyPheAla cat 8,6 -22,9 [2460]

ft ./K cat m 1 ,5 -26 [2460]

Нейтральная FaGlybeuAla ftcat 3,8 -37,2 [2460]

протеиназа Вас 111ив ft °*/K cat m 5,7 -14,5 [2460]

виЫ llle

*B трис-буфере. 'Калориметрические данные.

оба графика могут давать излом, так как при этом ft ./й-=й„й_/й (ft „+ft„), и

cat m с. о в —с. о

в зависимости от соотношения ft3 и ft_2 значения константы скорости второго порядка будут ft2/#e или ft2ft3/i(eft_2. Этот случай, по-видимому, наблюдается наиболее часто (1907,2452,2461,2462,2464].

Конформационные изменения, приводящие к изменению кинетических параметров ферментативной реакции, зарегистрированы в большом числе случаев (см.: [1661,2449]). Различные конформеры имеют, как правило, сильно отличающиеся термодинамические характеристики связывания и превращения субстрата. Например [2452], химотрипсин изменяет свое состояние при гидролизе п-нитрофенил-ацетата, что проявляется в изломе графиков 1п2г2-И/Т (при 20,9° С) и lnKe/ft2+1 /Г (при 20,1° G). Значения аН* и aS* при низких температурах составляют 20,5 ккал/моль и +13 э.е., а при высоких - 0,34 ккал/моль и -0,55 э.е. Активационные параметры деацилирования не зависят от температуры. Од-

5.6. Влияние температуры 231 »

нако для некоторых n-нитрофениловых эфиров 5-алкилфурил-2-кар0оновых кислот зависимость 1п?3 от 1/Т нелинейна, тогда как для других не наблюдается излома на графиках Аррениуса [2462]. По гидролизу AcTrpOEt (при рН 8) переход между двумя формами а-химотрипсина (Аъ и А±) наблюдается при 25° С (2461]. У пепсина переход между состояниями был обнаружен при 34° С для гидролиза АсРпеТуг (2465] и при 12° С для гидролиза ZLeuValPhe(N0?)AlaApm (19071. Таким образом, температура конформационного перехода может заметно зависеть от структуры субстрата.

Интересно сравнение параметров активации для термоустойчивого термолизина и близкой ему, но существенно более лабильной нейтральной протеазы Bacillus svbtllls. Последняя имеет значительно большую энтальпию активации (по ko&t/Km) и менее отрицательную энтропию, чем термолизин, что, по-видимому, связано с более "рыхлой" структурой нейтральной протеазы (24601.

Наконец, при больших величинах изменения удельной теплоемкости (дСр) дЯо и aSo являются нелинейными функциями температуры (2457,2463,24661, так как

1 аср 1пК = дЯ - + дЭ +--ШТ.

8 О у ° R

В связи с этим очевидны преимущества калориметрических измерений тепловых эффектов реакции при постоянной температуре. Такие определения для тепловых эффектов химических стадий очень немногочисленны (см., например: [24551), и пока их трудно сравнивать с данными по температурной зависимости кинетических параметров. Значительно чаще калориметрические измерения используются для определения энтальпии и энтропии равновесных процессов (ассоциация фермента с субстратом или ингибитором) [2467,24681. При этом данные, полученные методом калориметрии и методом температурной зависимости констант диссоциации фермент-лигандных комплексов, также довольно сильно различаются. Это видно из сравнения параметров дЯо и дЭо, полученных для химотрипсина (табл.57).

Таблица 57. Термодинамические параметры комплексообразования химотрипсина (рН 7,8)

Лиганд Метод ДЯ , о ккал/моль AS , о е.е. Литературный источник

Профлавин Кинетический -8,0 -6 [24691 •

Калориме триче ский -11,3 -18 [2468]

Ас-1-Trp Кинетический -9,06 -21 [2469]

Калориметрический -21 ,2 -61 [2468]

Ao-D-Trp Кине тиче ский -10,0 -23 [2469]

Калориметрический -19,0 -52 [2468]

Интересно, что связывание перечисленных в табл.57 лигандов модифицированными препаратами химотрипсина - Ые2-метилгистидин-57-а-химотрипсином или ангидрохимотрипсином - характеризуется примерно на 10 ккал/моль меньшей энтальпией и на 30 э.е. большим значением энтропии [24691. Термодинамические параметры связывания в этих случаях близки к величинам, характерным для пе-

232

Глава пятая. Регуляция и влияние внешних факторов

реноса ароматических соединений из воды в неполярную фазу (дЯо«0). Сходные параметры наблюдаются для связывания гидрофобных соединений трипсином [2470] и связывания субстратов пепсином [1907].

Как и для каталитических констант, отмечаются случаи нелинейной зависимости констант связывания от температуры (см., например: [2471]).

Измерения зависимости каталитических констант амидгидролаз от давления сравнительно немногочисленны (см., например: [2460,2472,2473]). В качестве примеров можно указать на изменения объема связывания субстратов термолизином и нейтральной протеазой Bacillus subtllls, которые в случае первого, термостабильного фермента составляют -20*-30 см3.моль-1, а во втором случае близки к нулю [2460]. Измерения hV* гидролиза химотрипсином ди- и три-пептид-п-нитроанилидов позволяют составить представление о числе водородных связей, образуемых субстратами в переходном состоянии, причем эти результаты хорошо согласуются с кристаллографическими данными (23351-

5.6.3. Компенсационный эффект

С эффектом компенсации мы уже сталкивались при рассмотрении специфичности субстратов химотрипсина. Это явление обнаруживается и при изучении многих других процессов (2450,2474-24761.

Термодинамический компенсационный эффект заключается в линейной зависимости изменений энтальпии (лН() и энтропии (aS() в ряду сходных процессов, происходящих при постоянной температуре, т.е.

Ш1 = a + TcASt, (22)

где а и Тс - постоянные, причем TQ имеет размерность температуры и называется температурой компенсации. Из этого определения следует, что свободная энергия в ряду исследуемых превращений остается постоянной. Коэффициент а=еЛ(-TcaS и является изменением свободной энергии при температуре компенсации.

Компенсационный эффект обнаруживается при многих ферментативных реакциях, как, например, в случае катализируемого химотрипсином гидролиза этилового эфира ацетилтриптофана при разных рН (рис.79) и многих других случаях.

Следует различать два типа компенсационных эффектов. Один, так называемый полный компенсационный эффект, имеет температуру компенсации, близкую к температуре'эксперимента. Этот тип эффекта, по-видимому, является артефактом, обусловленным близкими значениями измеряемых параметров (констант равновесия и скорости) в относительно узком диапазоне температур и неизбежными при этом ошибками. Поскольку в этом случае измеряемая величина, например константа равновесия

К = е~1Г е~~ШГ , (23)

является произведением двух сомножителей, то при K«const всегда будет наблюдаться компенсация д5( и дЯ(.

Однако, есть компенсационные эффекты с температурой компенсации, не сов-

5.6. Влияние температуры

233

Л/i','ккал/моль АН'ккал/маль

-8 -

—I-1-1_I_I _ 7 I_1_I,. I_1_I_I_I_I_I_I

-12 -14 -16 -18 AS°3.e. -12 -14 -16-18 -20-22-24-26 AS°3.e.

Рис.79. Компенсационные графики образования комплекса Михавлиса (ES) и ацилфермента (ЕА) в коде гидролиза этилового эфира Н-ацетил-Ь-триптофана а-химотрипсином при различных рН [2476]

падающей с температурой измерений и характеризующиеся малым разбросом точек. Существующие объяснения этих процессов [2476] связывают явление компенсации с изменением (деформированием и разрушением) структуры воды вблизи реагирующей макромолекулы. Эта точка зрения не разделяется другими исследователями, считающими, что компенсационные эффекты любого типа являются следствием "неправильного применения некоторых уравнений равновесной термодинамики" [2450, с.120]. Таким образом, природа компенсационного эффекта остается открытым вопросом.

5.6.4. Температурная устойчивость амидгидролаз. Термостабильные ферменты

Как уже указывалось, ферментативные реакции подчиняются уравнению Аррениуса (и другим термодинамическим зависимостям) в довольно узком интервале температур. Обычно при температурах, превышающих 40-45°С, наблюдается весьма резкое падение скорости реакции и увеличение констант диссоциации фермент-лигандных комплексов. Это обусловлено явлениями термической денатурации ферментов (рис.80) [2477,2478].

Здесь не будут рассматриваться проблемы денатурации белков, которым посвящены весьма полные обзоры [168,169,24791. Остановимся лишь на некоторых

Рис.80. Изменение относительной концентрации нативного химотрипсина в зависимости от температуры (30 мин инкубации) [2478]

определение по связыванию профлавина (1), начальной скорости гидролиза N-сукцинил-L-фенилаланил-п-нитроанилида (в условиях [S]o»[E]q) (2), начальной скорости гидролиза n-нитрофенилацетата (з), изменению величины впадины на кривой ДОВ химотрипсина при 233 нм (4)

234

Глава пятая. Регуляция и влияние внешних факторов

особых случаях, касающихся амидгидролаз. Температурная устойчивость большинства" амидгидролаз животных ограничена указанным выше пределом в 40-45°С. Ферменты растений обычно несколько более устойчивы (температура денатурации около 50-60°С) (24801. Известно довольно большое число амидгидролаз, продуцируемых термофильными микроорганизмами, устойчивость к температуре которых необычно высока (табл.58) (2481-24831.

Термостабильность металлсодержащих протеаз зависит от наличия металла в буферном растворе. Так, аминопептидаза Bacillus stearotKermaphlllcus, ус-тойчивая в растворах, содержащих ион Са , в отсутствие этого иона инакти-

Таблица 58. Некоторые термостабильные амидгидролазы

Фермент Источник Температура инкубации, °C Время инкубации, мин Остаточная активность Температурный оптимум,°С Литературный источник

Кукумизин Дыня Сисит1 в melo 70 10 «90 75 [436]

Нейтральная протеаза Вас 11Ъив aubt 1Ив 50 15 100 57 [2486]

Термолизин Вас 11Ъив thermopro— tealytleue 80 60 5.0 [1102]

а-Лити-ческая протеаза Lyaobacter sp. 50 480 30 [2487]

Аминопептидаза Bad I lua в t hear о t her -mophlIlсив 80 300 100 90 [1011 ]

it Telaromycea cLupont I 65 240 50 65 [1012]

Термоми-колин Malbranchea pulchel la 73 110 50 — [381]

Протеаза Aapergi I lua ochraceua 55 10 90 40 [2488]

Aapergi I lua oryzae 50 60 100 58 [2489]

Cephaloapor acremonaa 60 10 90 40 [2490]

Me l алго carpua albomycea 60 20 100 55 [2491 ]

Mucor pua i lua 55 15 100 55 [2492]

Myriococcuc albomycea 65 15 95 55 [2493]

Penici 11 turn cJupont i 65 15 100 70 [2494]

Penici 11 turn roqueforti 80 20 90 50 [1113]

" Torula t hermoph ila 60 60 100 55 [2495]

Термитаза Thermoact ino— mycea vulgaria 55 120 (СаС12) 120 80 [394]

5.7. Криоэнзииология амидгидролаз

гз5

вируется при 80°С за 1 ч на 65% [1011I. Термолизин весьма устойчив в присутствие ионов Са2+ [381]. Стабилизирующее действие на амидгидролазы оказывают многие ингибиторы, в том числе и субстратоподобные соединения [168, 2484], а также в некоторых случаях - АТР [24851.

другая особенность инактивации, свойственная только протеолитическим ферментам, - это автолитическое расщепление-, происходящее особенно эффективно при повышении температуры (см. разд.5.11).

Следует отметить, что до сих пор не существует общепризнанных представлений о причинах термостабильности некоторых белков, хотя в этом направлении ведутся обширные теоретические и экспериментальные исследования [2496-2500]. Два фактора, по-видимому, играют доминирующую роль - гидрофобные взаимодействия и конформационная энтропия разворачивания глобулы. Предпринимаются попытки увеличить стабильность ферментов методами направленного мутагенеза (25011.

Температурная устойчивость амидгидролаз и многих других ферментов может быть сильно увеличена при иммобилизации, т.е. химическом или сорбционном связывании с нерастворимым носителем (см. обзор: (25021). В качестве примера укажем здесь лишь на иммобилизацию а-химотрипсина в структуре сшитого полиакриламидного геля. Удалось получить препарат фермента, выдерживающий длительное кипячение в воде [25031.

5.7. Криоэнзииология амидгидролаз

Если верхний предел температурной устойчивости ферментов удается отодвинуть методами иммобилизации, то нижний предел, связанный с температурой замерзания растворов, можно преодолеть, используя смеси воды с органическими растворителями, имеющие низкую температуру замерзания. Эти методы, ставшие основой криоэнзимологии, подробно описаны в ряде обзоров и монографий (2421, 2504-25061.

Впервые исследование ферментативного гидролиза при отрицательных значениях температуры было предпринято в 1964 г. [25071 с использованием смесей метанол - вода. Дальнейшие обстоятельные исследования свойств различных смесей при низких температурах позволили рекомендовать условия, когда диэлектрическая проницаемость смеси соответствует величине, характерной для водных растворов при нормальной температуре [24211.

В криоэнзимологических исследованиях используются также концентрированные растворы NaCl (2508,25091, ацетата

страница 36
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Химия протеолиза" (8.49Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
рижские озера коттеджный поселок
SMX1000I
женская спираль цены
вентиляция обучение онлайн

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(19.08.2017)