химический каталог




Химия протеолиза

Автор В.К.Антонов

а гидролиз специфических для химотрипсина субстратов (в 3 раза); рН-зависи-мость кинетических констант практически не меняется при увеличении ионной силы в области рН 6-10, однако при более кислых значениях рН (<5) наблюдается обращение эффекта ионной силы на ftcat (по гидролизу AcTyrOEt) для химотрипсина. В случае трипсина эффект ионной силы носит обратный характер -с увеличением концентрации соли уменьшается ft и ft ./К (для BzArgOEt

с а "С с а "с m

примерно в 2 раза) и увеличивается Кт (24151, причем изменение рН в интервале 5-7 не сказывается на этом эффекте. Концентрация соли влияет в случае

Рис.76. Зависимость кинетических констант катализируемого химотрипсином гидролиза этилового ефира N-ацетилти-розина от концентрации Nad (рН 7,9;

25°С) [2415]

224

Глава пятая. Регуляция и влияние внешних факторов

химотрипсина, в основном, на константу скорости ацилирования фермента №2) и в меньшей степени на константу скорости деацилирования №3).

По своему эффекту различные катионы располагаются в ряд-, идентичный лио-тропному ряду Гофмейстера:

Ка+ >Li+ >К+ >nh* >Ые „n+,

4 4

а анионы - в следующий ряд:

S02~>Cl">Br~>Ac0">N0r>i->C10T>cns~.

4 3 4

Влияние соли на константу диссоциации фермент-субстратного комплекса, по крайней мере, в случае химотрипсина, можно объяснить так называемым высаливающим эффектом, т.е.. влиянием на активность субстрата (7g) при постоянстве активностей фермента (7Е) и фермент-субстратного комплекса (7ES) [2416]. Это справедливо при относительно больших концентрациях соли. При переходе от низких ее концентраций к высоким (больше 0,5 М) происходит, по-видимому, изменение конформации фермента (2416,2417 3, что проявляется в параллельном с изменением активности изменении поглощения белка при 282 нм [24163.

Карбоксипептидаза А в отличие от химотрипсина ингибируется анионами, причем эффективность ингибирования снижается в ряду:

po3">so2_>k:>ci".

д 4. з

Предполагается, что ионы фосфата и хлора взаимодействуют с остатком Arg в субстратсвязывающем центре [24183, а ион n~ взаимодействует с атомом Zn [2419З. Следует отметить, что избыток ионов Zn подавляет активность карбоксипептидазы А [24203 и ряда других Zn-содержащих протеаз.

5.4. Влияние органических растворителей

Органические растворители могут влиять на каталитическую активность ферментов, и в том числе амидгидролаз, изменяя диэлектрическую проницаемость раствора и коэффициент распределения субстрата между фазами растворителя и белка, а также специфически конкурируя с субстратом за активный центр. Кроме того, растворители, содержащие нуклеофильные функциональные группы, могут конкурировать с водой в гидролитических реакциях. Здесь будут кратко рассмотрены лишь два первых эффекта растворителя.

Изменение диэлектрической проницаемости влияет на ионизацию компонентов буфера и на рХа поверхностных групп белка (см. обзор в: [24213). Это в свою очередь приводит к изменению рйа групп, маскированных внутри глобулы, в том числе и групп активного центра фермента. Изменение констант диссоциации карбоксильной и аминогруппы в зависимости от содержания органического растворителя в воде может достигать нескольких порядков (рис.77) (2422,24233.

Имеется много данных о влиянии изменения диэлектрической проницаемости на каталитические свойства ферментов (обзоры ранних работ см. в: [2424З, с.205; 2425, гл.153). Так, линейная корреляция скорости катализируемого трипсином гидролиза BzArgOEt и обратной величины диэлектрической проницаемости (1/D) была обнаружена для большого числа смесей воды с органическими

5.5. Кинетический изотопный эффект растворителя

225

Ю,0(

Рис.77. Зависимость рй ионогенных групп

некоторых соединений от концентрации диске ана в воде

1- уксусная кислота; 2- трис;

3- бензоиларгинин; 4- глицин (СООН);

5- глицин(НН3+)

5,0<

растворителями [2426]. Изменение состава среды относительно мало влияет на ft t. но значительно изменяет величину Кт (2423,2427,24283. рН-Зависимости ftcat в воде и в водно-органических смесях практически не отличаются (24233. ЗЗыло покавано (24293, что многие протеазы в водно-органических растворителях теряют амидазную, но сохраняют эстеразную активность. Исследования влияния органических растворителей на кинетику ферментативного гидролиза осложняются специфическими эффектами, о которых говорилось выше (2427,24303, а также довольно узким диапазоном изменений диэлектрической проницаемости, используемым в большинстве работ. Изучение гидролиза AcTrpOEt и BzArgOEt, катализируемого соответственно химотрипсином и трипсином в широком интервале значений диэлектрической проницаемости, показало отсутствие корреляции 1/D и значений ftcat и йт- В системах, где превалируют электростатические фермент-субстратные взаимодействия, изменения диэлектрической проницаемости среды не влияют на йт. В то же время наблюдается хорошая корреляция lgftcat/?m и величины свободной энергии переноса субстрата из воды в смешанный ¦ растворитель. По-видимому, влияние органического растворителя на йт проявляется в том случае, когда в образование.фермент-субстратного комплекса существенный вклад вносят гидрофобные взаимодействия (24313- При высоких концентрациях органического растворителя исследования осложняются денатура-ционными процессами, однако этого не происходит, если реакцию проводить с суспендированным в сухом органическом растворителе ферментом.

Было показано (2032,2432-2435 3, что в этих условиях химотрипсин, субтилизин и ряд других ферментов сохраняют свою активность в отношении таких реакций, как, например, переэтерификация. При этом наблюдается ряд необычных эффектов - теряется энантиоселективность фермента (20323, способность к дискриминации между полярными и гидрофобными субстратами (2432 3, наблюдается обращение специфичности к конкурентным ингибиторам (24333, появляется своего рода лигандиндуцируемая "память" фермента при его предобработке ли-гандом (24353. Ферменты приобретают значительно более высокую стабильность к температуре и хранению (24333.

5.5. Кинетический изотопный эффект растворителя

Изучение кинетического изотопного эффекта растворителя дает важные сведения о механизме реакции и структуре переходного состояния (см. обзоры: (1405, 24363). В случае ферментативных реакций проведение процесса в D20 может вызвать изменение кинетических параметров не только за счет изменения скорости переноса протона на лимитирующей стадии, но и изменения сольватации

15. В.К. Антонов

226

Глава пятая. Регуляция и влияние внешних факторов

белка, конформации белковой молекулы и т.д. Замена Н20 на D20 приводит к сдвигу наблюдаемого значения рН раствора так, что рН и pD связаны эмпирическим отношением

рН = pD + 0,4.

В то же время рКа ионизирующихся групп возрастает в Б20. Эти два эффекта ¦могут компенсировать друг друга.

Как видно из табл.55, для большинства исследованных амидгидролаз кинетический изотопный эффект составляет 2-3. Противоречивые данные получены для пепсинового катализа, где некоторые субстраты не изменяют ftcat в D20, а другие дают близкий к обычному изотопный эффект.

Наблюдаемый сдвиг рй& каталитически активных групп составляет 0,5±0,2 единицы. Влияние D20 на Кт проявляется обычно так, что эта величина уменьшается, т.е. фермент-субстратный комплекс (в тех случаях, когда Кт=Кв) становится прочнее. Это обусловлено, по крайней мере частично, увеличением гидрофобных взаимодействий в D20.

Таблица 55. Влияние DO на ферментативный гидролиз

fecat К'Ш?0) Литера-

Фермент Субстрат pH m d. турный источник

*cat а-Химотрип-син CH,C00CJi„N0 -n о о 4 d. 7,43 . 2,40 - [2441]

AcTyrOEt 8 1 ,8 - [2311 ]

AcTrpHH2 8 1 ,9 - [2311 ,2441 ]

Трипсин CHoC00C,H,N0„-n 7,5 1 ,38 - [2441]

BzArgOEt 7,5-8,5 3,03 2,8 [2441 ,2443]

BzPheValpNA 7,44 4,3 - [2441 ]

Эластаза CH,C00C^H.N0„-n 3 о 4 d. 7,5 2,45 - [2441 ]

" Тромбин BzArgOEt 8,0 2,92 - [2441 ]

Папаин Циннамоил-имидазол 6,5-8,5 3,35 - [1984]

Пепсин AcPheTyrOMe 2,5 1 ,05 - [2444]

(Gly)„Phe(N0_)- 4 2,0 1 [2445]

-OMe J *

Карбокси- BzGlyPhe 7,47 1,33 1,55 [2446]

пептидаза А

Аспарагиназа АБП 7,12 2,93 - [2447]

Eecherlchla

coll

Глутаминаза Gin 5,5 1,8 - [2447]

Eech&rIchla

col I

Широкое распространение получили исследования зависимости скорости реакции от доли D20 еН20 [1504,2437-2442]. Эти исследования позволяют сделать вывод о числе протонов, переносимых в переходном состоянии. Типичная зависимость такого рода представлена на рис.78.

Наконец, интересную информацию'дает изучение температурной зависимости

5.6. Влияние температуры

227

Ac-Trp-NH. рН 8,25°

РИС.78. Типичные зависимости отношения скорости ферментативной реакции в воде (V ) к

скорости в смеси D„0-H„0 (V ) от доли (п) 0,0 в Н20 [2439] * tL

1- однопротонный катализ; г- катализ с переносом нескольких протонов

кинетического изотопного эффекта. Как было показано [2443,24481, при гидролизе химотрипсином и трипсином эфирных субстратов энергия активации одинакова как в D20, так и в Н20 и кинетический изотопный эффект целиком обусловлен изменением предэкспоненциаль-ного множителя. Этот факт трактуется как свидетельство применимости для ферментативного катализа квантово-механической модели переноса протона, включающей его туннелирование (см. гл.З).

Wn

5.6. Влияние температуры и давления 5.6.1. Теория

Как и для всякой химической реакции, зависимость константы скорости от температуры в реакциях, катализируемых амидгидролазами, описываются уравнением Эйринга-Поляни (см. обзоры: И661,24491):

kT ьБ* ьН* 1

lnfe = In — +-----, (17)

h R R T

где к - константа Больцмана; Т - абсолютная температура; h - постоянная Планка; R - универсальная газовая постоянная; дБ* - энтропия и дН* - энтальпия активации.

Температура также влияет на константу диссоциации фермент-субстратного ¦ комплекса в соответствии с уравнением Вант-Гоффа

дБ дН .

— о о 1

ШК =----, (18)

в Д R Т

где Ке = 1/Ae, a aSq и дНо - энтропия и энтальпия комплексообразования.

Константа скорости второго порядка ft2/As будет, таким образом, связана с температурой выражением:

й_ , m дБ^-дй дН^-дН *

2 kl о о I Ш — = 1П — + —--(-)—. (19)

К h R R T

3

Строя зависимости логарифмов кинетических констант от обратной температуры, можно определить значения lS*, aSq, дН* и дНо-

Особенности температурной зависимости ферментативных реакций по сравнению с неферментативными являются следующие: 1) значения энтальпии и энтро-

228

Глава пятая. Регуляция и влияние внешних факторов

пии ферментативного процесса могут иметь смысл, только если соответствующие кинетические константы относятся к элементарному акту химического превращения субстрата или к истинной константе равновесия (то же, несомненно, справедливо и для неферментативной реакции, но в этом случае проверить выполнимость указанного требования значительно легче); 2) зависимость кинетических констант от температуры, описываемая уравнениями (17)—(19), соблюдается для ферментативных реакций в сравнительно узком интервале температур, определяемом точкой замерзания раствора и устойчивостью фермента к тепловой денатурации; 3) температура может изменять рКа каталитически активных групп фермента и тем самым изменять скорость реакции; 4) на графиках Аррениуса для ферментативных реакций часто наблюдаются изломы, причины которых будут обсуждены ниже.

Существует мнение (24501, что уравнение Эйринга-Поляни и эмпирическое уравнение Аррениуса

неприменимы к реакциям биополимеров. Основная аргументация при этом сводится к следующему: а) дН* и дЕ - независимые величины, а связывающее их выражение

имеет лишь тот смысл, что существует некоторая температура Т, при которой зависимости lnfe от 1/Г, описываемые уравнениями (17) и (20), имеют одинаковый наклон; б) постоянство &S, А, дН и дЕ в ферментативных реакциях кажущееся, обусловленное узостью температурного интервала измерений; б) даже в этом узком интервале изменение температуры приводит к изменению структуры биополимера; г) образование фермент-субстратного комплекса приводит к значительным перестройкам белковой молекулы.

При всей основательности этой критики все же измерения кинетических констант в зависимости от температуры широко используются для характеристики ферментативных реакций; по-видимому, они имеют смысл, особенно, если проводится сравнение серии однотипных субстратов. Кроме того, широкое распространение получают прямые калориметрические методы измерения тепловых эффектов реакции, лишенные ряда перечисленных недостатков, а также расширяется диапазон температур измерений с использованием криоэнзимологических методов (см. разд.5.7).

Как равновесие обратимой реакции, так, следовательно, и скорость ее могут изменяться при изменении давления. Экспериментально это обнаруживается при давлениях, превышающих 1000 атм. Изучая влияние давления на константы скоростей ферментативных реакций, можно получить важные сведения об их механизме (см. раРзд.5.6.2). Измерение влияния давления на Кт позволяет вычислить изменение объема (дУ) при образовании комплекса Михаэлиса, а из данных по изменению константы скорости можно получить величину объема активации (дУ) (24511:

дЕ

lnfe = 1п4--

ВТ

(20)

ДЕ - ВТ

(21)

5.6. Влияние температуры

229

Infe = 1пй--Р,

о RT

где й ¦- константа скорости при Р = 0+1 атм.

Строя зависимости логарифма константы от давления получают прямую (если

aV^ не зависит от давления) с наклоном---. Объем активации прямо связан

КГ

с энтропией активации и характеризует изменение в структуре переходного состояния по сравнению с основным состоянием реагирующей системы.

5.6.2. Экспериментальные данные

Анализ данных табл.56 позволяет сделать вывод о том, что специфичность фермента может определяться изменением как энтальпии, так и энтропии активации. Относительный вклад каждого из этих параметров зависит от типа катализатора и выбранной серии субстратов. Так, скорость деацилирования К-ацил-аминоацилхимотрипсинов определяется, в основном, изменением энтальпии активации (см. рис.60), тогда как переход от этих производных к соответствующим производным фермента, ацилированного алифатическими кислотами, приводит к изменению энтропии активации стадии деацилирования, а энтальпия процесса изменяется очень мало (1992). Энталышйный "контроль" четко проявляется при пепсиновом катализе, тогда как в случае эластазы преобладает вклад энтропии.

Представление о том, что специфичность определяется уменьшением числа вращательных степеней свободы "хорошего" субстрата, т.е. определяется, главным образом энтропией основного состояния [1987), оказалось неправильным. Как было показано (1992,2453), данные, лежащие в основе этих представле

страница 35
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Химия протеолиза" (8.49Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
плитка herkulanum
часы дисней детские
Домашний 50 л
купить гироскутеры по низким ценам

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(06.12.2016)