химический каталог




Химия протеолиза

Автор В.К.Антонов

вор

профлавина с рН 9,5); б - 7-химотрипсин. Фермент инкубировали в буфере с

рН , смешивали с профлавином в концентрированном фосфатном буфере с рН_„ и о кон

измеряли разностное поглощение А465)

Пунктирная линия соответствует быстрой ассоциации профлавина с активной формой фермента. Кинетические кривые иллюстрируют скорость превращения неактивной формы в активную

Скорость перехода из активной конформации в неактивную относительно невелика (й=0,6 с-1 при рН 6,3 и 25° С (23061) и поэтому может влиять на наблюдаемые кинетические параметры гидролиза субстрата.

Другие примеры конформационных изменений, происходящих при изменении рН, можно найти в работах по бромелаину (23091, клострипаину (7431, карбоксипептидазе Y (2310.1 и т.д.

Таким образом, определяемые из данных по рН-зависимости значения рйа групп фермента во многих случаях являются кажущимися значениями, приписать которые тем или иным функциональным группам довольно сложно. Это усугубляется еще и тем. что значениия рйа групп в белке могут сильно отличаться от их значений в модельных соединениях.

5.2.3. Экспериментальные данные

Из данных, приведенных в табл.54, видно, что связывание субстратов, как правило, мало изменяет рйа каталитически активных групп амидгидролаз. Для свободных ферментов значения рКа мало зависят от типа субстрата, хотя встречаются исключения, которые трудно объяснить различиями в условиях определения. Особенно большие различия наблюдаются у пепсина. Так, значение рйа для свободного фермента в случае субстратов, содержащих остаток His, совершенно иное, чем с нейтральными субстратами. То же самое наблюдается для пептидов GlyGLyPhePheOEt, BzLysPhePheOEt и др. (1878,23331, а также для

5.2. Влияние рН среды

219

Таблица 54. Значение рй групп активных центров некоторых амидгидролаз

Фермент Субстрат* рйа свободного фермента йа фермент-субстратного комплекса Литературный источник

а-Химотрипсин AcTrpOEt AcPheAlaMH2 6,77 6,8 6,86 6,6 [2311 ] [2298]

HTrpOEt - 5,45:7,5:7,25 [2312]

Р-Трипсин ZLysOHp HLysOMe 4,5:7,1 4,6;7,1 5,42,6.57,7.25 [2313, 2314] [2315]

Р-Калликреин панкреатический BzAlaOMe ZLysOHp 7,08 4,4:6,9 6,7 4,4;6,9 [2316] [2314]

Эластаза лейкоцитарная AoAla3pHA 7,16 6,91 [2317]

Карбоксипептидаза Y ZPheLeu AcPheOEt 4,4:6,5 5,9:8,9 5,4:7,7 5,2;9-,1 [2318] [2318]

Папаин ZLysOHp(pH<6) ZAlaOP BzArgpNA 3,35:4,0 3,56;8,07 4,3;8,2 [2319] [2320] [2321 ]

Клострипаин BzArgOEt 6,4:8,35 8,25 [2322]

Пепсин ZPhe(N02)PheApm 2,9:4,2 4,3 [2323]

AoPheTyrNH2 1i,17;4,35 1,35:4,15 [2324]

AoPheTyrOH ZHlsPhePheOEt 1 ,17 3,7;>5 1,12;3,7 3,5; 5,2 [2324] • [2325]

Химозин ZHisPheTrpOEt 2,9:5,4 - [2326]

Карбоксиеп-тидаза А ZGlyGlyLeu NBzPlaOH 6,T9t9,11 9,4 6,28;9,3 [2327] . [2328]

Термолизин PALeuNH2 6,2:7,8 - I [2329]

Лейцинамино-пептидаза (хрусталик) HLeupNA (Mg+) 8,8 [2330]

Аминопепти-даза Аегстопаз HLeupNA 4,9:7,55; ю,о;.10,7 5,3 ' [2331 ]

р-Лактама-за II Бензилпенициллин 5,6;Т,& ! 5,25;8,2;9,8 [2332J

В-Лактамаза РвеиЫотопае Цефаллоспорин 5,5:9,8 4,2;8,3;10,7 [2332]

*ONp - n-нитрофениловый вфир; ОР - фениловый ефир; pNA - n-нитроанилид; Apm - Н-(3-морфолино)-цропиламид; NBz - n-нитробензол; РА - фурилакрилоил.

пептидов, содержащих аминопропилморфолиновую С-защитную группу (2323). Ни одно из этих соединений не должно изменять свое состояние ионизации в области исследуемых значений рН.

По-видимому, значения рйа пепсина и некоторых других аспартатных протеаз не характеризуют ионизацию групп активного центра (23341.

Различия рйа свободного пепсина для субстратов, содержащих свободную и защищенную С-концевую карбоксильную группу, обусловлены ионизацией послед-

220

Глава пятая. Регуляция и влияние внешних факторов

ней при рН«3,5 [2335-2337J. Это сопровождается увеличением константы диссоциации фермент-субстратного комплекса [2338]. Следует отметить, что наличие фосфатной грушш в пепсине влияет на значения рйа фермента [1216,23391. Так, было показано, что рйа комплекса фермента с АсРпеТугОМе у дефосфорили-рованного пепсина равны 2,1 и 4,6, тогда как для нативного фермента эти значения составляют 1,6 и 4,1 [1216].

В табл.54 для свободного химотрипсина приведено одно значение рйа, хотя на самом деле обычно наблюдается еще одно значение в области 8,8-9,0. Это последнее значение обусловлено обсуждавшимся выше конформационным переходом в неактивную форму. Интересно отметить, что 6-химотрипсин более стабилен в щелочной среде, чем а-химотрипсин [2066,2306].

Исследования, проведенные в широком диапазоне рН показали, что смена лимитирующей скорость стадии - довольно частое явление. Так, при гидролизе n-нитрофениловых эфиров ациламинокислот трипсином [23131 и панкреатическим калликреином [2340] в кислых рН лимитирует общую скорость стадия деацилирования, а при рН>4,4-4,8 - стадия ацилирования. В случае лейкоцитарной элас-тазы [23171 и папаина [23411 наоборот - в кислых рН медленной стадией является ацилирование, а при увеличении основности среды такой стадией становится деацилирование фермента.

Осложнения в определении рКа каталитически активных групп могут возникнуть и вследствие недостаточно продуманного выбора условий. Например, определение рКа химотрипсина при низких рН (5-6) и высоких концентрациях фермента приводит к неправильным результатам, так как эти условия максимально благоприятны для димеризации фермента, влияющей на величину fecat [2298]. В папаине (2342-23471 рКа остатка Cys25 зависит от того, включена ли его SH-группа в солевую связь с HIs159 или нет. В то же время рйа HIs159 также зависит от наличия или отсутствия солевой связи. Кинетические исследования не позволяют различить два состояния, несущие одинаковый суммарный заряд:

R-S"____HIm+ и R-SH____Im.

Поэтому для решения вопроса об ионизации каталитически активных групп папаина широко используются физико-химические методы и методы химической модификации. Из физико-химических методов, используемых для определения рйа каталитически важных групп фермента, следует в первую очередь отметить ЯМР (2348-23521, а также ИК-спектроскопию (2353-23551, разностную УФ-спектро-скопию (2356,23571 и флуоресцентный анализ [2356,2358].

Использование методов химической модификации для тех же целей описано в работах [2359-2363]. Влияние рН на конформационное состояние фермента удается выявить при рентгеноструктурном анализе кристаллов, выращенных при различных значениях основности среды (23521.

5.3. Влияние ионов и ионной силы раствора

Следует различать специфическое и неспецифическое действие ионов на ферменты. Специфическим является действие лишь одного типа ионов (анионов или катионов), тогда как неспецифическое действие вызывается ионами разной природы за счет изменения ионной силы раствора и обычно связано с их лиотропны-

5.3. Влияние ионов и ионной силы раствора

221

ми свойствами. Многие амидгидролазы содержат в своем составе конституи-тивные ионы, играющие роль простетических групп. Влияние этих ионов рассмотрено в других разделах.

5.3.1. Специфические ионы

Ряд катионов и анионов могут активировать или ингиОировать амидгидролазы. Среди активаторов наибольшее распространение имеют ионы Са2+ и Mg г\ Ионы Са2+ связываются с такими сериновыми протеазами, как химотрипсин, трипсин, эластаза и др. Однако они, как правило, не влияют на активность этих ферментов, а стабилизируют их в отношении автолитического расщепления (2364-23713. Ниже приведены константы ассоциации некоторых сериновых протеаз с ионами Са2+ [2368-23713:

Фермент К-10~4, М~1* Фермент К-Ю~Л, М~1*

а-Химотрипсин Трипсин свиньи Трипсин быка Эластаза "Приведены значе 0,92 22,0 11 ,0 21 ,0 ния для наиболе Термомиколин Субтилизин BPN' Термитаза Протеиназа К эе прочно связывающез 50,0 10б 108 103 чэся иона Са2+.

Исследования связывания Са удобно проводить, вытесняя этот ион некоторыми ионами лантанидов (Tb3+, Ln3+, Gd3+) и измеряя флуоресценцию присоединяющихся ионов (ТЬ3+) или сдвиг линий в спектрах ЯМР [2372-23743. Эти исследования, а также рентгеноструктурные данные позволили установить И 233, 23753, что в трипсине ион Са2+ связывается в области остатков 70-80, образующих полипептидную петлю, причем акцептором иона служит Glu80. В химо-трипсине в этом положении расположен остаток Не, что объясняет значительно более низкое сродство Са2+ к этому ферменту. Субтилизины и близкие им ферменты связывают от 2 до 4 ионов Са2+ с разной степенью прочности.

Активация ионами Са2+ была обнаружена для катионных химотрипсина и трипсина из поджелудочной железы овец [2763, акрозина [3353, термомиколина [3813 и ряда других сериновых протеаз.

Среди цистеиновых протеаз наряду с ферментами, активируемыми Са2+-иона-ми, такими, как клострипаин [7433, имеется группа протеаз (калпаины), проявляющие абсолютную Са2+-зависимость, т.е. практически неактивных в отсутствие этих ионов [2376-23793 (см. табл.12).Эти протеазы содержатся в мио-фибриллах гладких мышц, они не являются лизосомальными ферментами и, по-видимому, участвуют в катаболизме белков мышечной ткани.

Существует по крайней мере два типа калпаинов - калпаины I, активируемые микромолярными концентрациями ионов Са2+ (физиологическая концентрация »Ю мкМ [23803 и калпаины II, нуждающиеся в миллимолярных концентрациях этого иона. Оба типа калпаинов состоят из двух субъединиц - каталитической (около 80 кДа) и регуляторной (28-30 кДа). Было показано, что как тяжелая, так и

222

Глава пятая. Регуляция и влияние внешних факторов

легкая субъединицы содержат по 4 потенциальных Са2+-связывающих участков [886,8921, причем имеются два типа таких* участков - с высоким и низким сродством к Ga2+ [2381]. Эти участки расположены в С-концевом 4-м домене четырехдоменной тяжелой субъединицы и во 2-м, тоже G-концевом домене двух-доменной легкой субъединицы. Са2+-связывающие центры имеют характерную "Е-Р" структуру [23821: Asp(Glu)-(Xaa)-(Asp)Glu-(Yaa)68Glu. Каталитический центр калпаинов расположен в домене II тяжелой субъединицы. Этот домен может взаимодействовать с доменом IV, что приводит, по-видимому, к дерепрес-сии или активации фермента, как это имеет место в случае активации калъмо-дулином. Другой возможный механизм активации - взаимодействие этого домена с легкой субъединицей. Следует отметить, что автолиз легкой субъединицы повышает необходимую для активации концентрацию Са2+ калпаина I [2383,23841, однако остается неясным, имеется ли связь между этим явлением и существованием двух типов калпаинов. Механизм репрессии-дерепрессии, возможно, связан с наличием в клетках эндогенных белковых ингибитора и активатора калпаина [2385,23861. Активатор (Мг<*40 кДа) действует полностью антагонистически ингибитору, увеличивая сродство фермента к Са2+ примерно в 100 раз [23871. Ионы Са2+ могут также влиять на ассоциацию протомеров в олигомерных ферментах [23881.

Довольно подробно изучено влияние Са2+ на свойства металлсодержащей эн-допептидазы - термолизина [2389-239И- Здесь Ga2* играет роль в сохранении термостабильности этого фермента [2390]. Термолизин связывает 4 иона Са2+ с константами К1 2=2,8-109 М-1 и К3 4>10б М-1 [23921. Два из них расположены рядом внутри молекулы в области остатков белка Asp138, Glu177, Asp185,. Glu190 и Asp191, а третий и, возможно, четвертый ионы Ga2+ расположены близко к поверхности в области остатков 196-200. Наиболее близко располо-

р. о

женный ион Са отстоит от активного центра фермента на расстоянии 13 А [2393,23941. Са2+ активирует также аминопептидазу А [9791, коллагеназу [10951 и некоторые другие металлсодержащие протеазы.

Многие 2п2+-содержащие аминопептидазы активируются ионами Mg2* или Мп2+ [951,9541. Ионы Mg2* связываются с лейцинаминопептидазой из хрусталика глаза с Kr«2-10~6 М. При этом наблюдается увеличение 2?cat по гидролизу LeuNH2 с 1,1-105 до 1,19-106 мин-1 без изменения величины К [9541- Активация лей-цинаминопептидазы развивается во времени (3-6 ч-при 30°). Анионы проявляют' синергический эффект при активации катионами металлов (2395,2396].

По-видимому, довольно специфически действуют ионы Ка+ и К+ на активность нейтральной протеазы из гипофиза быка (8051 и на активность щелочной протеазы из мышц карпа [1971, ингибируя эти ферменты.

Ионы тяжелых металлов действуют специфически на цистеиновые амидгидролазы. Этот факт был установлен еще в 1930 г. Кребсом [23971. Наиболее активными ингибиторами цистеиновых протеаз являются ионы ртути. Такие металлы, как Си2+ или Ag+, ингибируют некоторые сериновые протеазы. Эти ионы избирательно тормозят ацилирование сериновых протеаз специфическими и неспецифическими субстратами, но не влияют на стадию деацилирования ацилфермента [2398]. Химотрипсин ингибируется также ионами РЬ2+ [23991, Zn2+, Ni2* и Cd2+ [2400].

Специфическое влияние на активность амидгидролаз оказывают не только ка-

5.3. Влияние ионов и ионной силы раствора

223

лтюны, но и анионы. Отмечено, что ион хлора активирует некоторые амидтодро-лазы - дшептидижарбоксипептидазу (ангиотензинпревращающий фермент) [24011, формилметионинаминопептидазу [8233, аргиниламинопептидазу [682, 2402], катепсин G [2403] и дрожжевую аминопептидазу I [957]. В первом случае ион хлора влияет как на V"max, так и на Кт, причем оказалось, что характер действия зависит от типа используемого субстрата [2404]. Было показано [2405], что С1~-ион изменяет спектральные свойства дипептидилкарбоксипепти-дазы, что, вероятно, связано с изменением конформации фермента. Этот ион взаимодействует с остатком лизина фермента [2406]. В некоторых случаях ион хлора действует как аллостерический активатор (см. разд.5.10) и может быть заменен ионами Вг~, I-, GNS- и др. (957]. Наконец, следует упомянуть специфическое действие фосфат-ионов на некоторые амидгидролазы. Так, фосфат-ион заметно изменяет специфичность стафиллококковой протеазы [18521: в фосфатном буфере этот фермент расщепляет связи, образованные остатками как Asp, так и Glu, а в аммонийном буфере - только связи, образованные глутаминовой кислотой. Полифосфаты (в том числе и АТР) увеличивают каталитическую активность катепсина D [2407], причем этот эффект лишь частично может быть объяснен изменением ионной силы раствора. Неорганический фосфат влияет на активность глутаминазы [2408,2409], аллостерически активируя этот фермент (см. также разд.5.9 и 5.10).

5.3.2. Влияние ионной силы раствора

Добавление солей может изменять каталитические свойства ферментов за счет увеличения ионной силы раствора [1404, гл.7; 2410]. Этот вопрос был подробно исследован на примере сериновых протеаз - химотрипсина и трипсина [2411-24151- Было показано, нто при гидролизе этилового эфира ацетил-Ь-ти-розина химотрипсином изменение концентрации NaGl приводит к пропорциональному увеличению ft и уменьшению К (рис.76) (24151. Интересно, что ионная

сила оказывает даже больший эффект на гидролиз химотрипсином специфических для"трипсина субстратов типа BzArgOEt (примерно в 8 раз по ftcat/xm), чем н

страница 34
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Химия протеолиза" (8.49Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
Газовые котлы Baxi SLIM EF 1,31
как выкатать вмятину на крыле авто
обучение шитью на швейной машинке
КНС Нева рекомендует леново моноблоки - офис: Санкт Петербург, ул. Рузовская, д.11, - есть стоянка для клиентов.

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(07.12.2016)