химический каталог




Химия протеолиза

Автор В.К.Антонов

медведя kkks L rkvl kehgl ЩВ^Р lkkhspnpas

| - основные расщепляемые связи.

1 - минорные расщепляемые связи.

i » - связи, не расщепляемые вследствие основного остатка в Р3~положении.

идет в плазме крови двухступенчато с образованием активированной промежуточной формы за счет индуцируемого Н+-ионами конформационного изменения и .последующего протеолитического расщепления по связи Arg-beu под действием ферментов плазмы - калликреина или плазмина [2267].

Значительно сложнее происходит активация прокарбоксипептидазы А [2268, 2269]. Этот зимоген состоит из трех субъединиц, из которых лишь одна -субъединица I - является собственно зимогеном карбоксипептидазы А, а две другие - химотрипсиноген С и неактивная форма эластазоподобного фермента -протеазы Е [503,2270]. Прокарбоксипептидаза А имеет молекулярную массу около 45 кда [2271] (другая форма у свиньи 71 кда [2272]) и значительно быстрее активируется трипсином, будучи выделена из комплекса (в виде сукцинили-рованного производного), чем в составе комплекса. При этом отщепляется около 100 аминокислотных остатков (2273-2276] и образуется смесь нескольких форм фермента, отличающихся N-концевой аминокислотой (см. разд.2.4.4). Следует отметить, что в поджелудочной железе акулы прокарбоксипептидаза содержится в мономерной форме t3031.

Интересно упомянуть данные о процессинге мембранного фермента препени-циллиназы из Bacillus lichenlformis [2277,2278]. Зимоген этого фермента и сам фермент - липопротеины, содержащие в положении Cys27 (профермента)-аце-тилглицеридную группу. Активация идет путем расщепления связи Gly26-Cys27, причем липидный остаток, по-видимому, определяет локализацию белковой цепи в мембране.

Как уже отмечалось, у многих микробных амидгидролаз нет проформы, т.е. истинного зимогена. Активация происходит сразу после отщепления лидерной (сигнальной) последовательности. Вообще предполагается [4], что зимогены появились на поздних этапах эволюции. Так, у трипсиногенов морских звезд, по-видимому, нет предшественников (22791, нет их и у химотрипсиноподобных

14»

212

Глава пятая. Регуляция и влияние внешних факторов

ферментов из Streptomyces griseus [2280].

Интересно рассмотреть отличия в пространственной структуре ферментов и их зимогенов. Этот вопрос был подробно исследован на примере пары а-химо-трипсин - химотрипсиноген А [1229,2281-2283]. Наибольшие изменения происходят в области расщепляемых связей 11е16 и Arg145. Остаток 11е16 имеет решающее значение для формирования активного центра фермента, так как он образует солевую связь своей аминогруппой с карбоксильной группой остатка Asp194, которая в зимогене экспонирована в область связывающего субстрат участка белка. Существенные изменения происходят и в области остатков 189-193, образующих эту субстратсвязывающую область. В результате активации химотрипсиногена происходят два важнейших события - формирование субстратсвя-зывающего участка и формирование так называемой оксианионной полости за счет изменения ориентации карбонильной группы остатка Gly 193 [1229.1. Что касается каталитического аппарата - "системы переноса заряда", образуемой остатками Asp102-HIs57-Ser195, то в зимогене она сформирована более четко, чем в самом ферменте [1229]. По-видимому, вследствие этого химотрипсиноген обладает некоторой каталитической активностью. Как химотрипсиноген, так и трипсиноген медленно реагируют с диизопропилфторфосфатом [22841 по каталитически активному остатку серина, связывают конкурентные ингибиторы [2285], а трипсиноген образует прочный комплекс с панкреатическим трипсиновым ингибитором [1233,2286]. Было показано [22871, что пептиды (например, IleVal) индуцируют переход трипсиногена в конформацию, характерную для трипсина, т.е. эти пептиды способны как бы замещать N-концевой фрагмент зимогена, формируя связывающий участок активного центра. Предполагается, что аналогичный механизм реализуется при активации плазминогена стрептокиназой [2287,2288].

Таким образом, по крайней мере для трипсина и химотрипсина основное различие зимогенов от активных протеаз - конформационное. Это подтверждается также данными по химической модификации ферментов (см., например: [2289, 22901) и многочисленными физико-химическими исследованиями [2291-22931-

Необходимо отметить, что различие в конформациях зимогена и фермента сказывается, по-видимому, в большей степени на активности в отношении специфических субстратов и в меньшей степени на активности в отношении "плохих" субстратов [2290,22941.

5.2. Влияние рН среды

Диапазан активности амидгидролаз охватывает интервал примерно в десять единиц рН. Внутри каждой группы ферментов область активности локализована в более узких пределах. Однако встречаются ферменты, функционирующие в области, далекой от оптимума рН для большинства представителей данной группы.

Исследования рН-зависимости кинетических констант ферментативного гидролиза и особенно констант скоростей индивидуальных стадий процесса дает важную информацию о характере групп фермента, участвующих в связывании субстрата и его превращении, а также о механизме реакции (см. обзоры: И 613, 1459,1661 1 ).

5.2. Влияние рН среды

213

5.2.1. Кинетические закономерности

Изменение констант скорости и равновесия фермент-субстратного взаимодействия обусловлены изменением состояния ионизации участвующих в этих взаимодействиях групп. В простейшем случае изменение рН приводит к протонированию или депротонированию по крайней мере двух ионизирующихся групп фермента, участвующих в катализе:

ЕН2 --- EH2S

IL Ка й

cat

EH *—-» EES-- EH + P. (1 )

Кь I I 4

E -e-* ES

Если все три формы фермента (Е, EH й ЕН2) способны связывать субстрат, но химическое превращение происходит только с одним комплексом (например, EHS), то соответствующее выражение для скорости реакции будет:

(Й У/')[Е] (S]

cat * ' о о К f/f + (S)

(2)

где / = 1 + (h+]/tf +iL/[h+] и /' = 1 + [h+]/tf4JL/[h+] - так называемые рН-

а Ь а о

функции Михаэлиса И661, с.138].

Таким образом, получаемые в эксперименте кинетические константы будут связаны с концентрацией водородных ионов следующими соотношениями:

cat

ftcat =-;--<3>

1 + (н+]/й' + й:/(н+]

а Ь

К (1 + Ш+]/Х + JL/[h+]) ат = -, (4)

1 + ш+]/к' +

а Ь

к УК = {к ./К )-, (5)

cat m * cat m '

1 + [H+]/if + Кк/Ш+] а Ь

где й и К - относятся к предельным, независимым от рн значениям констант. Из этих уравнений ясно, что в простейшем случае зависимости й и Кт от рН уравнения (3) и (4) отражают ионизацию групп в фермент-субстратном комплексе, а соответствующая зависимость kcat/Km - ионизацию групп свободного фермента.

Очевидно, что в области высоких концентраций ионов водорода членами, включающими Кь и в уравнениях (3)-(5), можно пренебречь. Логарифмируя полученные при этом условии выражения, для й t, К и йоа1/йт имеем;

214

Глава пятая. Регуляция и влияние внешних факторов

lgfccat-lg(1 + [H+]/KV),

lgK - = lgK +lg(1 + [H+]/К -lg(1 + [H+]/К*),

Igk JK = lg(ft VK )-lg(1 + (H+]/tf ). №oat m ° cat m ov a

(6) СП (8)

Как видно, при [Н+]«йа (и К'а) соответствующие константы не зависят от рН, а при (и К')

cat

ptf'+pH,

cat cat

lg—— = lg—— ptfa+pH.

(9)

(10)

pKa*6,75

Что касается значений Km, то при К =К^ оно не зависит от рН. Если же соблюдается условие К «(H+]«K' или Й'«(Н+]«Х , то уравнение (7) редуцируется до

выражений, аналогичных (9) и (10). Таким образом, строя зависимости логарифмов кинетических констант от рН, можно определить значения рКа и рКа (рис. 73). Аналогично определяются значения р^ и рй^ (2295,2296].

Рис.73. рН-Зависимости кинетических констант гидролиза этилового вфира Н-ацетил-Х-тирозина а-химотрипсином

(25°С; Ц=0,1)

2 -

10рН

Предложены также и другие приемы определения этих величин (2297,2298]. В более сложных случаях, например при четырех ионных состояниях фермента Е, ЕЯ, ЕН"2 и ЕН3 рН-функция Михаэлиса имеет вид:

Ш+] (Ш+])г /• * = 1 + - + - +

Ь а Ъ

к

(Н+]

(11)

где Кс, Къ и Ка - константы ионизации форм ЕН, и ЕН3 соответственно. Зависимость lgkcat от рН в этом случае будет представлять собой ряд отрезков с наклонами +2, +1, 0 и -1.

Субстратами многих амидгидролаз являются соединения, несущие ионогенные группы. Учет ионизации субстрата приводит к довольно сложным зависимостям кинетических констант от рН. Для простейшего случая, когда фермент связывает только одну форму субстрата, а константа диссоциации свободного фермента и фермент-субстратного комплекса одинаковы:

5.2. Влияние рН среды

215

ЕН? + S

EH + S «—

*ь 1 1 Ч

Е + S «-ES

-* EH2S

К К к +

а " cat -- EHS -• EH + Р,

(12)

скорость реакции выразится так:

cat

S + Н+,

v

--[Е] IS1

1 + [Н+]/К + JL/[H+] ° ° а Ъ

К (1 + К [Н+]) + [S]

(13)

5.2.2. Интерпретация значений констант ионизации

При выводе уравнений, связывающих кинетические параметры с рН, делается ряд допущений, а именно: 1) группы ведут себя как идеально титрующиеся кислоты и основания, причем изменение состояния ионизации других ионогенных групп, не участвующих в связывании и превращении субстрата, не влияет на ионизацию рассматриваемых групп; 2) активна только одна форма фермента; 3) процессы переноса протонов осуществляются быстрее химических процессов; 4) лимитирующая скорость всего процесса стадия остается одной и той же при всех значениях рН; 5) фермент устойчив при всех значениях рН [2299].

Рассмотрим подробнее выполнимость этих условий. Белок содержит большое число ионогенных групп, расположенных обычно на его поверхности. Состояние ионизации этих групп может влиять на рйа групп, участвующих в связывании субстрата и в катализе [2300]. Ниже приведены значения рКа каталитически активных групп химотрипсина и его производных, имеющих различный поверхностный заряд (1613, с.177]:

Фермент Тип модификации P*a

Химотрипсин Сукцинилхимотрипсин Этилендиаминхимотрипсин E-Lys (NH3 )->E-Lys (ИНС0СН2СН2С00~) Asp(COO") Asp(C0NHCH2CH2NH3) 4}lu(COO-) %}lu(C0NHCH2CH2NH+) 7,0 8,0 6,1

Эффекты поверхностного заряда особенно сильно проявляются при низких ионных силах раствора. Следует отметить, что сукцинилирование практически не изменяет конформацию химотрипсина [2301].

Условие активности только одной формы фермента обычно выполняется, хотя известны случаи наличия на кривых рН-зависимости двух или более максимумов,

216

Глава пятая. Регуляция и влияние внешних факторов

которые можно интерпретировать как результат активности нескольких ионных форм. Это явление, однако, может быть связано также или с наличием в препарате примесей другого фермента, активного при ином значении рН, или с процессами активации анионом (например, хлора) и т.п.

Условие быстрого установления прототропного равновесия, как правило, выполняется. Наиболее сложный и интересный вопрос заключается в постоянстве лимитирующей скорость стадии.

Уже для простейшей схемы

*1 \ Е + s «-» es -> Е + Р,

-1

подчиняющейся не (й_ wftg), могут

кинетике Михаэлиса (й «й^), а кинетике

Бриггса-Холдейна

возникать сложности, обусловленные изменением соотношения й и й2 при изменении рН. Так, оказалось (2297,2298,2300,2302), что рйа сбобоЭкого химотрипсина для быстро гидролизуемого субстрата п.-нитрофенило-вого эфира ацетил-Х-триптофана на 0,3 единицы меньше, чем рКа по гидролизу этилового эфира или амида ацетил-Ь-фенилаланина (рйа свободного фермента, по определению, не должно зависеть от типа субстрата) (рис.74).

Это обусловлено тем, что при высоких рН для тг-нитрофенилового эфира соблюдается условие йэ>й_,, а при по-

рКц(фермент) ----

нижении рН

условие й2>й й2 становится

1'

меньше й

1 •

Кинетический / рКр . /

т.е. при

низких -

высоких рН й /К =й , а при

й ./К =й_/й

cat m 2 а

^cat/Km ~(ke/Ks)*tРИС.74. График, поясняющий различие

между истинным и "кинетическим" рй в

а

механизме Бриггса-Холдейна, обусловленное изменением лимитирующей стадии с изменением рН [2298]

Наблюдаемое кинетическое значение константы ионизации в этом случае рав-

но:

К. = К

& а

Й2+Й-1

(14)

где Ка истинная константа ионизации группы фермента. В случае трехстадийной схемы:

Е + S

-» es

ЕР? +

Е + Р,

изменение рН может приводить к смене лимитирующей скорость стадии. При этом, если обе стадии контролируются группами с разными значениями рйа (или

5.2. Влияние рН среды

217

рйа груш меняется при переходе от одной стадии к другой) зависимость й и Кт от рН могут иметь довольно сложный характер, однако смена лимитирующей скорость стадии не должна сказываться на виде зависимости й Уй от рН.

cat m

Если на пути от субстрата к продукту образуется не один, а несколько фермент-субстратных комплексов, например:

Й1 й2 йз Е + S ^-» ES =«г=-* E*S -> Е + Р,

то кинетический параметр

fecat *А

К m

где

(15)

ft_2+ft3

Очевидно, что и здесь измеряемое в опыте значение рйа свободного фермента может зависеть от типа субстрата в том случае, если изменение рН по разному влияет на йр для разных фермент-субстратных комплексов.

Значения рйа, получаемые из рН-зависимости величин ftcat и йт, могут отличаться от истинных значений рйа ионизации групп фермент-субстратного комплекса, если значительная часть субстрата связывается непродуктивно. В этом случае наблюдаемое значение рйа (рйа) будет [20001:

Рк; = Рка - ig (16)

где Кий*- константы равновесия между продуктивными (HES и ES) и непродуктивными (HES' и ES') комплексами. Значение рйа свободного фермента (из зависимости йса1/Ят от рН) не будет изменяться при наличии непродуктивного связывания.

Многие амидгидролазы неустойчивы при крайних значениях рН, подвергаясь обратимым или необратимым конформационным изменениям. В общем виде зависимость каталитических констант от рН в случае перехода одной формы фермента в другую рассмотрена в работе (23031. Протеолитические ферменты, кроме того, могут подвергаться автолизу (см. разд.5.11). Например, большинство аспартатных протеаз устойчиво лишь в кислой или слабокислой среде и необратимо инактивируются при рН>6. Сериновые протеазы обратимо инактивируются в сильнокислой среде [13751. Весьма подробно была исследована обратимая инактивация химотрипсина при высоких значениях рН (2304-23081. Оказалось, что уже при рН 6-8 раствор этого фермента содержит около 10% неактивной формы, теряющей способность связывать субстрат (рис.75). Конформационный переход активной формы химотрипсина в неактивную обусловлен разрывом солевой связи Ile16-Asp194, причем в неактивной форме аминогруппа 11е16 имеет нормальное значение рйа (7,8), а в активной - существенно более высокое (*ю). Субстраты и субстратоподобные ингибиторы смещают равновесие в сторону активной формы.

218

Глава пятая. Регуляция и влияние внешних факторов

РИС.75. Кинетика связывания профлавина химитрипсином при различных рН, иллюстрирующая наличие неактивной формы фермента [2306]

а - а-химотрипсин (на вставке: к ферменту при рН 6,84 добавляли раст

страница 33
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Химия протеолиза" (8.49Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
аренда школьных автобусов
обучение по водоподготовке
ручка-скоба имперо оф сет мт107z23
шиповки для футбола mizuno

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(11.12.2017)