химический каталог




Химия протеолиза

Автор В.К.Антонов

и, которое проявляется на разных уровнях структурной организации субстратов. Специфичность амидгидролаз, кроме этого, может проявляться на разных стадиях каталитического процесса - на стадии связывания субстрата и его химической трансформации. Во многих случаях изменение структуры субстрата ведет к увеличению ftcat без улучшения и лишь по достижении максимальной для данного фермента (и данной серии субстратов) каталитической константы наблюдается снижение константы михаэлиса. Для относительно простых серий субстратов

4.9. Заключение

205

специфичность удается описать количественно соотношениями типа линейных зависимостей свободных энергий, а в более сложных случаях - получить эмпирические корреляции на основе статистического анализа специфичности. Однако специфичность многих амидгидролаз не поддается такому анализу. Особенно это касается некоторых ферментов, специфичность которых приближается к абсолютной (например, ренин). Эффективность амидгидролаз изменяется в зависимости от типа субстратов в широких пределах. В то же время для ряда ферментов найдены субстраты, гидролизуемые с константами скоростей, близкими к диффу-зионно-контролируемым процессам. Таким образом, эффективность ферментативного гидролиза, по-видимому, не лимитируется какими-либо особенностями химических механизмов катализа.

Глава пятая

РЕГУЛЯЦИЯ И ВЛИЯНИЕ ВНЕШНИХ ФАКТОРОВ

Регуляция активности амидгидролаз может осуществляться как на уровне их биосинтеза, так и на посттрансляционном уровне. В этой главе мы рассмотрим лишь второй тип регуляции, причем рассмотрим возможности изменения активности этой группы ферментов как In vivo, так и в энзимологических экспериментах вне организма.

Проблемы регуляции активности амидгидролаз рассмотрены в многочисленных обзорах [6,2197-21991. Наиболее распространенный способ, особенно характерный для протеаз животных, заключается в активации зимогенов - неактивных предшественников протеолитических ферментов. Образующиеся при ограниченном протеолизе зимогенов активные ферменты сами могут служить активаторами других зимогенов, давая начало "каскаду" последовательных ступеней активации.

Активность ферментов, в том числе и амидгидролаз, сильно меняется при изменении состава среды - концентрации водородных ионов, ионной силы, характера микроокружения. Последнее имеет особенно важное значение для амидгидролаз, связанных в мембранных структурах. Важное значение имеет и температура среды, в которой они функционируют.

Еще один весьма эффективный способ регуляции активности амидгидролаз -это действие на них ингибиторов. Ниже мы рассмотрим действие как природных, так и синтетических ингибиторов.

Наконец, протеолитические ферменты обладают присущей только им способностью к самоинактивации - автолизу.

Все эти воздействия создают весьма сложную и, очевидно, достаточно тонкую систему регуляции активности амидгидролаз в организме.

5.1. Зимогены и их активация

Как стало ясно, особенно при анализе структур генов, подавляющее большинство белков синтезируется клеткой в виде предшественников, которые затем "созревают", превращаясь в биологически активные белки.

Не составляют исключения и амидгидролазы. Предшественники обычно содержат на N-конце полипептидной цепи так называемую сигнальную последовательность, состоящую из 15-30 аминокислотных остатков (см. обзор: (22001). Эта последовательность в различных белках не имеет практически никакой гомологии, однако в ней можно выделить три участка: п - участок, включающий различные остатки, но в целом характеризующийся положительным зарядом, h -участок (около 10-30 остатков) богат гидрофобными аминокислотными остатками и образует гидрофобный кор и с - участок, обычно незаряженный, но включающий полярные остатки. Собственно участок, расщепляемый сигнальными протеа-зами структурно соответствует так называемому правилу "-1.-3", согласно которому в положении -1 находится преимущественно Ala, а в положении -3 нет ароматических или заряженных остатков (18541.

Сигнальный пептид связан с пропоследовательностью. Размеры этой последо-

5.1. Зимогены и их активация

207

Рис.70. Схема активации зимогенов пищеварительных ферментов [5]

вательности довольно сильно различаются. Так, у химотрипсиногена она включает 15 остатков [2201], а у субтилизина из Bacll\us виЫШз - 77 остатков [2202]. Эта последовательность уже связана с последовательностью зрелого белка. В случае химотрипсиногена после отщепления проучастка (по связи Arg-Ile) образуется неактивный зимоген, а в случае субтилизина - активный фермент.

Ключевое положение в системе активации многих ферментов поджелудочной железы занимает трипсин, который образуется из трипсиногена под действием энтеропептидазы (энтерокиназы) и активирует большинство других зимогенов (рис.70) (5,2203].

Активация бычьего и некоторых других трипсиногенов происходит в присутствии ионов Са2+ и сопровождается отщеплением N-концевого гексапептида [22041:

I

ValAspAspAspAspLys-IleVal...

В случае свиного трипсиногена отщепляется октапептид [22051:

I

PheProThrAspAspAspAspLys-IleVal...

Энтеропептидаза катализирует этот процесс примерно в 2000 раз эффективнее, чем трипсин, который также способен активировать трипсиноген.

Для активационного пептида трипсиногена характерно наличие четырех остатков аспарагиновой кислоты, что позволяет N-концевому фрагменту локализоваться на поверхности глобулы и препятствует маскированию расщепляемой связи. Наличие большого числа заряженных аминокислотных остатков в активацион-ном пептиде типично для многих зимогенов.

Действие трипсина на химотрипсиноген А приводит к разрыву связи Arg15-

208

Глава пятая. Регуляция и влияние внешних факторов

11е16, и образуется активный химотрипсин [22061. Эта форма фермента весьма нестойка и превращается за счет последовательных расщеплений связей Leu13-Ser14, Туг146-Тпг147 и Азп148-А1а149 соответственно в S-, %(а^)- и а-химотрипсины. Эти превращения происходят автолитически [1205,2206,2207]. Установлено также образование минорных форм р.- и оьхимотрипсинов [12051.

В случае химотрипсиногена В наряду с отщеплением дипептида Ser14-Arg15 происходит катализируемое химотрипсином отщепление трех аминокислот, соответствующих последовательности Азп147-А1а148-Leu149 [2208]. У свиного химотрипсиногена С и катионного химотрипсиногена акулы разрыв первой связи происходит в последовательности Arg15-Val16 [2209,2210].

Предшественник одного из ключевых ферментов системы свертывания крови -тромбина - протромбин образуется в печени в виде пробелка, включающего 43 остатка сигнального (лидерного) пептида [2211], причем его биосинтез зависит от наличия в организме витамина К (см. обзор: [2212]). Бычий протромбин - гликопротеин с молекулярной массой 70 кДа, построенный из 582 аминокислотных остатков, образующих одну полипептидную цепь (3171. Этот белок содержит 10 остатков необычной 7-карбоксиглутаминовой кислоты [2213], по-видимому, играющей важную роль при связывании протромбином ионов Са2+. Активация протромбина происходит In vivo под действием факторов коагуляции Ха и Va, ионов Са2+ и фосфолипида (протромбиназа) (2212]. При этом расщепляется связь Arg273-Thr274 и образуется гликопептид с молекулярной массой «33 кДа и белок, называемый промежуточным белком II. На второй стадии активации расщепляется связь Arg323-Ile324 и образуется двухцепочечный активный тромбин (39 кда) [2214,22151-

Активные факторы Ха и Va являются, в свою очередь, продуктами активаци-онного. каскада (рис.71), начинающегося с активации фактора Хагемана (фактор XII), который и служит инициатором последовательных реакций активации в системе свертывания крови (4171, в кининоген-кининовой системе (22161, в системе фибринолиза (активация плазминогена) [22171 и, по-видимому, в системе активации комплемента (22181. Последняя способна также активироваться автокаталитиче ски (2219,22201.

Фактор XII (Фактор Хагемана)

г-—\-------------

Фактор XIIа

V

ПлазмииогЕН Плазминоген ПроактиВатор Активатор

Плазминоген Плазмин

XI

XI а

Прокалликреин Калликреин

Кининоген "^/U/huh Х^ ~^Ха Протромбин Тромбин

Фибриноген Фибрин Фрагменты

рис.71. Схема каскадных процессов, индуцируемых фактором Хагемана, и их взаимосвязь

5.1. Зимогены и их активация

209

Активация инициирующего каскад фактора XII идет, по-видимому, автоката-литически и существенно ускоряется поверхностями, имеющими заряд (стекло, каолин, декстрансульфат). Образующийся фактор ХНа (активный) может катализировать превращение прокалликреина в калликреин. Последний в присутствии декстрансульфата ускоряет превращение XII в ХНа в 11 ООО раз по сравнению с условиями, когда заряженный компонент в системе отсутствует. [2221].

Другая важная сериновая протеиназа - акрозин образуется из предшественника путем отщепления как К-, так и С-концевого пептида, содержащего большое число остатков пролина [2222]. Аналогичная картина наблюдается у аква-лизина [22231, эластазы нейтрофилов и катепсина G [22241, причем у последних собственно активационный пептид состоит всего лишь из двух остатков -Gly и Glu. Предшественники обнаружены у коллагеназ [22251, растительных сериновых карбоксипептидаз [22261 и других ферментов. Интересно, что препос-ледовательность играет важную роль в правильном сворачивании белковой цепи некоторых микробных протеиназ - субтилизина [22271 и а-литической протеиназы [22281. Еще один пример необычного механизма активации - активация фактора роста нервов [22291. Этот белок содержит 1 атом цинка, который подавляет автокаталитическую активацию. При разбавлении раствора белка цинк диссоциирует и происходит активация профермента.

Для цистеиновых ферментов не удалось обнаружить предшественников. Исключение составляет протеаза из стрептококков [745,746,22301. Внутриклеточная форма зимогена этого фермента содержит свободную SH-группу, которая в процессе транспорта во внеклеточное пространство превращается в метилдисульфид (-S-S-Me). Восстановление этой связи приводит к активации и автопроцессингу проформы (34 кДа) в активный фермент (28 кДа). Кристаллический папаин после выделения имеет очень низкую каталитическую активность, которая проявляется лишь в присутствии тиоловых соединений, восстановителей или СГГ-иона [13311. Были получены убедительные данные [2231,2232], что в неактивном па-паине каталитически активный остаток цистеина блокирован дисульфидной связью и представляет собой остаток цистина:

E-S-S-CHg-CH-COOH.

Возможно, что сходного типа неактивные предшественники имеются и у других цистеиновых протеаз.

Протеолитическое расщепление двухцепочечного (80 и 26 кДа) профермента калпаина II происходит автокаталитически по малой субъединице, в результате чего отщепляется фрагмент в 9 кДа и образуется фермент, активируемый низкими концентрациями Са2+ [2072,22331-

Проферменты аспартатных протеаз животных устойчивы в нейтральной и слабощелочной среде и претерпевают автокаталитическую активацию при понижении рН среды до 2-4 [22341. При этом в конечном счете отщепляется около 40 аминокислотных остатков с N-конца молекулы зимогена.

Механизм активации пепсиногена достаточно сложен. Биосинтез этого зимогена происходит в специальных клетках стенки желудка [22341 в виде препро-фермента, содержащего 14-15 остатков лидерной последовательности (2235, 2236]. Существенным этапом активации является, по-видимому, конформационное

14. В.К. Антонов

210

Глава пятая. Регуляция и влияние внешних факторов

изменение, происходящее при переходе пепсиногена в кислую среду и приводящее к образованию каталитически активного зимогена - б-пепсиногена [2064, 2086,2237-22391- Далее, в зависимости от рН, может происходить или внутримолекулярный процесс отщепления активационного пептида [22401;, или межмоле-

происходить в одну или две стадии. Так, пепсиноген свиньи активируется преимущественно в две стадии - сначала расщепляется связь Leu16-Ile17, а затем связь Leu44-Ile45 [2065,2241-22441; в пепсиногене кур и химозине также происходит отщепление сначала продукта гидролиза по связи Phe27-Leu28 и лишь затем происходит разрыв связи Leu42-Thr43 (куриный зимоген) или Phe42-Gly^3 (химозин) (2127,2245,22461. Следует отметить, что, по крайней мере, для прохимозина расщепление по связи 27-28 не является обязательным. При рН 4,5-прохимозин, в котором направленным мутагенезом изменена последовательность в этой области, нормально активируется, однако при рН 2 активация не происходит [21271. В пепсиногене А человека внутримолекулярно расщепляется связь Leu23-Lys24, а межмолекулярно - связь Leu47-Val48 [22471. Вообще, участок первоначального расщепления зависит от структуры активационного пептида и специфичности образующегося фермента. Наличие в положении Р активационного пептида основных аминокислотных остатков препятствует разрыву на этом участке [22461 (табл.53). Интересно, что пептид 1-16 довольно сильно ингибирует активность пепсина (837,2248-22521. Активация пепсиногенов происходит также под.действием ряда ферментов микроорганизмов (22531.

Другая аспартатная протеаза - катепсин D также синтезируется в виде предшественника с молекулярной массой 53 кДа [1168,2254-2258], который последовательно превращается в промежуточную форму с Мг 47 кДа и затем в двух-цепочечную - 31 и 13-14 кДа (у бычьего профермента за счет выщепления ди-пептида SerSer (22591). Активация происходит внутри лизосом и сопровождается расходованием АТР, по-видимому, для повышения концентрации Н+-ионов [22581. Предполагается, что в активации прокатепсина D участвует цистеино-вая протеиназа.

Почечный ренин также синтезируется в виде препрофермента с Мг«50 кДа, содержащего 20 остатков лидерного пептида и 46 остатков пропоследователь-ности [22601. Неоднократно сообщалось [2261-22641 об обнаружении высокомолекулярных, неактивных форм этого фермента, причем предполагалось [22651, что эта форма представляет собой комплекс ренина с кислотолабильным ингибитором. Однако, по-видимому, это проренин '[2263,2266]. Активация проренина

У зимогенов разных аспартатных протеаз отщепление активационного пептида может

кулярная реакция активации [2064,2234!.. Эти два процесса, по-видимому, конкурируют, и в зависимости от рН преобладает один или другой (рис.72).

Рис.72. рН-Зависимость констант скорости 1-го (к.) и 2-го (&_) порядков реакции ак-

тивации пепсиногена (вертикальные линии -среднее квадратичное отклонение) [2240]

5.1. Зимогены и их активация

211

Таблица 53. Последовательность в области расщепляемых участков у зимогенов аспартатных протеиназ (по [2246])

Пепсиноген а свиньи ?5 10 15 20 30 35 ? ? 1 ? :?* Г V rkks l rqnljikdgk lkd»f lkthkhnpas То же быка kkks lIrqnlIiengk lke»p mrthkynlgs Прохимозин теленка kgks L rkal kehgl led fjlqkqqygiss Пепсиноген кур kgks L rkql kdhgl led Pi lkkhpynpas

Прогастриксин человека kpksi/lretm kekgl led Pi lrthkydpas

Пелсиноген а человека rkks l RRTL sergl LKdIp lkkhnlpark

Пепсиноген III3 обезьян RKKS L rrnl sehgl LKDJf lkkhnlnpas

"

страница 32
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Химия протеолиза" (8.49Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
Перейди по ссылке получи скидку с промокодом "Галактика" в KNS - Epson EB-1940W - поставщик товаров для дома и бизнеса.
zwilling в спб
садовая скамейка купить недорого
imagine dragons гастроли в россии 2017

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(28.03.2017)