химический каталог




Химия протеолиза

Автор В.К.Антонов

активность

199

приводят к сдвигу рКа His64 от +0,08 до -1,0 единицы [21163. Замена Asn155 - Leu, не влияя на Кт, снижает активность более, чем в 200 раз. Авторы [21223 рассматривают этот факт, как подтверждение гипотезы стабилизации ферментом переходного состояния субстрата (см. гл.7 и 8).

Весьма подробно была исследована роль остатков в связывающей субстрат полости субтилизинов BPN' и Bacillus lichenlformis в проявлении ими субстратной специфичности. Были произведены замены остатков в положениях 166, 156, 169 и 217. Остаток Gly166 заменялся на остатки различной гидрофобности, в результате чего были получены мутантные субтилизины с измененной специфичностью. Так, введение в положение 166 остатка Не увеличивает более, чем на порядок, значение йса1/Кт для субстратов, содержащих Ala в положении Р1, и снижает почти на три порядка это значение для субстратов с Рпе и Туг [21093. Замена сразу трех остатков Glu156, Gly169 и Туг217 в субтилизине BPN' на остатки, свойственные ферменту из Bacillus "lichenlformis (Ser156, А1а169 и Leu217), дает мутант со специфичностью, близкой последнему ферменту [21203. Наконец, замена в области связывания иона Са2+ Рго172 и Gly131 на остатки Asp увеличивает связывание этого иона в 6 раз [21213.

Довольно обширные замены были проведены в трипсине крыс [2119,2123-21263. Так, замена остатков Gly216 и Gly226 на Ala приводит к изменению предпочтительности фермента по отношению к Arg- и Lys-содержащим субстратам [2123,21243. Снижение при этом каталитической активности, по-видимому, обусловлено деформацией оксианионной полости фермента [2124З. Была также произведена замена субстратсвязывающего остатка Asp189 на остаток Lys. Фермент при этом теряет способность связывать и превращать субстраты с Lys или Arg в Р1, но приобретает слабую химотрипсиновую активность. Боковая цепь остатка Lys189 в мутантном ферменте, по-видимому, направлена вне связывающей субстрат полости [21261.

Мутация зимогена аспартатной протеиназы прохимозина [2127] в области участка процессинга (27-31) позволила установить, что этот фермент и, по-видимому, другие аспартатные протеиназы могут образовываться путем расщепления сразу по связи Phe42-Gly, а не обязательно через стадию отщепления пептида 1-27 (см. гл.5). Для другой аспартатной протеиназы - ренина замена А1а317 на Asp привела к сдвигу рН-оптимума на 0,5 единицы в кислую область [21281, что частично подтверждает роль этого остатка в проявлении ренином, в отличие от других аспартатных протеиназ, нейтрального рН-оптимума.

Имеются данные о направленном мутагенезе нейтральной эндопептидазы (3.4.24.11) (21291, вирусных протеиназ (2130,2131! и р-лактамаз [2132-21341. Так, заменой Ser70 в р-лактамазе (RTEM) на Cys была получена тиол-р-лактамаза, сохранившая частично активность по гидролизу бензилпенициллина и чувствительная к п-хлормеркурийбензоату - типичному ингибитору цистеиновых амидгидролаз.

Наконец, следует упомянуть весьма неожиданный результат замены остатка Туг248 в карбоксипептидазе А на остаток фенилаланина (21351- Такая мутация не изменила k . . и лишь несколько увеличила значение К . Поскольку феноль-

с&ь m

ному гидроксилу остатка Туг248 весьма основательно приписывалась роль общего кислотного катализатора в катализе этим ферментом (см. гл.7), такой результат заставляет пересмотреть сложившееся мнение.

200 Глава четвертая. Ферментативный гидролиз. Феноменология

4.7. Синтетическая активность амидгидролаз

Поскольку при нейтральных значениях рН константа равновесия реакции Яр

RC0NHR1 + Н20 -* RC00" + +H"3NR1

близка к единице (см. разд.3.1), при достаточных концентрациях реагентов протеолитические ферменты могут катализировать синтез амидной связи. Впервые такая возможность была продемонстрирована в 1937 г. (21363. В последующие годы интерес к препаративному ферментному синтезу пептидов значительно возрос в связи с возможностями препаративного получения некоторых ценных пептидов и белков (см. обзор: (2137]).

В качестве катализаторов используются а-химотрипсин (2138-2141], фицин (2142], термолизин [2141,2143-2145], карбоксипептидаза Y [2146,2147], микробные металлопротеиназы [588] и другие ферменты. Довольно хорошие результаты дает использование иммобилизованных ферментов [2148,2149], а также применение модифицированных ферментов, обладающих пониженной амидазной активностью, но сохраняющих эстеразную. К последним относятся тиолсубтилизин [2150] и NЕ—метил(His57)-химотрипсин (2151).

Специфичность ферментов в реакциях синтеза хорошо согласуется с их специфичностью в гидролитических реакциях [2139,2152]. То же самое относится к рН-зависимости пептидного синтеза [2151]. При использовании в качестве катализатора сериновых протеаз, они с эфиром быстро образуют ацилфермент и затем ацильная группа переносится на амин:

RCOOEt + Е-ОН-« RC00-E,

RC00-E + H2NR1-- RC0NHR1 + НО-Е.

Была подробно исследована кинетика реакции синтеза в таких условиях и предложены способы определения максимального выхода [2140,2143,2152,2153].

Основной вклад в изменение стандартной свободной энергии обратимой реакции синтеза-гидролиза амидной связи вносит ионизация продуктов гидролиза. Поэтому выгодно проводить синтез в условиях, когда оба реагента не ионизированы. Однако в обычных условиях этого достичь нельзя. Были предложены остроумные методы обхода этой трудности. Так, реакцию синтеза можно проводить, используя эфир ациламинокислоты и аминокомпоненту при рН«10, когда последняя не ионизирована.

Другой способ подавить ионизацию реагентов - это проводить реакцию синтеза в водно-органическом растворителе. При этом можно добиться очень значительного изменения константы равновесия (1424,2145,2154-2158]. Этим способом удается синтезировать не только пептиды, но и эфиры ациламинокислот [1424], равновесие для которых в водной среде сильно сдвинуто в сторону гидролиза. Следует отметить, что субтилизин сохраняет свою каталитическую активность в безводном диметилформамиде. Реакция в этом растворителе между эфирами карбоновых и ациламинокислот и углеводами позволила получить ацил-моносахариды с высокими выходами [2159]. Удачным для сегментного синтеза пептидов, оказывается замена части воды, добавляемой в органический растворитель, этиленгликолем, формамидом и пр. [2160].

4.8. Побочные реакции, катализируемые амидгидролазами

201

Методы пептидного синтеза с помощью протеаз были с успехом использованы для получения биологически важных пептидов - энкефалинов [216U, ангиотен-зина II [21621, секретина [21631, а также для модификации белков - соевого трипсинового ингибитора [2164] и рибонуклеазы А [21651.

Особенно впечатляющим является получение инсулина человека из свиного инсулина с помощью протеазы I из Achromobacter [588,21661. Этот фермент селективно отщепляет остаток А1а30 в В-цепи инсулина. Обработка такого дез-(А1аЗО)-инсулина избытком mpem-бутилового эфира треонина в присутствии того же фермента и органического растворителя привела после удаления mpem-бу-тильной группы к инсулину человека с выходом 85%.

4.8. Побочные и необычные реакции, катализируемые аиидгидролазами

Многие амидгидролазы катализируют не только реакции гидролиза и синтеза амидной связи, но и другие реакции, из которых наиболее интересной является реакция транспептидации.

4.8.1. Транспептидация

Известны два типа таких реакций: транспептидация по типу ацильного переноса [21671

Е

RCONHR1 + R2NH2 «-* RCONHR2 + R1NH2 (55)

и транспептидация по типу аминопереноса [21681 Е

RCONHR1 + R2C00H ^-* R2C0NHR1 + RCOOH. (56)

В этих реакциях исходный амид обычно называют донором транспептидации, а соединение, на которое происходит перенос фрагмента донора, - акцептором транспептидации. Акцептором может служить один из продуктов гидролиза субстрата (донора), например (21691:

2LeuTyrNH2-» LeubeuTyrNH2 + TyrNH2.

Реакция ацильной транспептидации катализируется многими сериновыми и цистеиновыми протеазами (2170-21721. Имеется единственное сообщение [21731 о том, что а-химотрипсин способен катализировать также реакцию аминопереноса

2ZPheLeu-» ZPheLeuLeu + ZPhe.

Аспартатные протеазы катализируют в основном реакции аминопереноса [2174-21761, однако, если донором служит соединение со свободной аминогруппой, то наблюдается также и ацильная транспептидация [2169,2177,2178]. Ами-ноперенос, катализируемый пепсином, идет преимущественно с донорами, содержащими свободную карбоксильную группу у переносимого остатка. Долгое время считалось [2176], что пепсин вообще не способен катализировать перенос за-

202 Глава четвертая. Ферментативный гидролиз. Феноменология

щищенного по карбоксильной группе остатка, но в дальнейшем выяснилось [16671, что низкие выходы в этой реакции по сравнению с переносом свободной аминокислоты обусловлены меньшим отношением скоростей транспептидации и гидролиза в последнем случае (табл.52).

Таблица 52. Кинетические параметры реакции транспептидации,

катализируемой пепсином (рН 4,6; 37°с); акцептор ZPhe(K02)0H [1667]

Донор к ио2, -1 мин Ц, мм* &5П .3) *5

&5(2.4) ^cat

1. AcPheTyr 3,1 0,156 1 ,06 0,019

2. АсТугТуг 2,93 0,424 0,046

3- AcPhePheApm** 4,65 1,7 0,95 7.6.10"3

4. GlyGlyPhePheApm 4,89 0,17 8.6.10'4

*?^=(fc_4+fe5)fe3/fc2fc4 (см. схему 13).

**Apm - 3-(морфолино)цропиламид. I 1 ...... - 1

Металлсодержащие эндопептидазы типа термолизина катализируют как амино-, так и ацильную транспептидацию (21731, а аминопептидаза (лейцинаминопепти-даза) - ацильный перенос (21791-

Для карбоксипептидаз до сих пор не обнаружена способность катализировать реакции транспептидации. Исключение составляют D-аланинкарбоксипептидазы [256,2180,21811, катализирующие реакции типа

R-D-Ala-D-Ala + H2NR'-> R-D-AlaNHR' + L^-Ala.

Важнейшее феноменологическое отличие транспептидации от реакции синтеза пептида заключается в том, что транспептидация всегда идет только в присутствии субстрата, тогда как ресинтез пептида может происходить при наличии в системе только продуктов гидролиза пептида и катализатора.

Выходы продуктов транспептидации существенно выше равновесных выходов продуктов синтеза,- если реакции проводить при низких концентрациях реагентов. Действительно, выход продукта синтеза определяется константой равновесия в реакции -

йр (RC00H1[R NHgl

R-C00H + R1NH2 =-RC0NHR1 + Н20, где = —-.

[RC0NHR11

В равновесии при йр«1 и [RC00H1=[R1NH21=0,01 М концентрация пептида составит 0,0001 М, т.е. выход будет 1%. В реакциях транспептидации при концентрациях донора и акцептора 0,01 М выход продукта транспептидации может достигать 100%. Это понятно, так как для реакции

Ц [RCONHR2][R1ffiI2]

RC0NHR1 + R2NH2 ^ RC0NHR2 + R1NH2, где Ц = -

[RC0NHR1][R2NH21

4.8. Побочные реакции, катализируемые амидгидролазами

203

константа равновесия (К^,) всегда будет близка к единице, а равновесная концентрация продукта

[RC0NHR2] - -/rCONHR1 ][R2NH2]K^,

при равных концентрациях субстрата и акцептора будет равна концентрации исходных веществ. На самом деле выходы транспептидации существенно ниже из-за параллельно протекающих процессов гидролиза как субстрата, так и продуктов переноса.

Специфичность ферментов в реакциях транспептидации целиком аналогична их специфичности в реакциях гидролиза [2182]. Любая модификация фермента, снижающая активность в отношении гидролиза, пропорционально понижает их активность в реакциях транспептидации. Очевидно, что катализ в обоих случаях обусловлен функционированием одних и тех же групп активного центра.

Использование хромогенного акцептора позволило [16671 измерять начальные скорости реакции транспептидации по типу аминопереноса. Было показано (см. табл.52), что константа скорости транспептидации [кинетическая схема (13), разд.4.11] одинакова для разных доноров, содержащих одну и ту же переносимую группу (при одном и том же акцепторе). Это означает, что перенос осуществляется из общего для разных доноров комплекса.

4.8.2. Обмен кислорода в карбоксильной группе ацилашшокислоты

Если инкубировать ациламинокислоту с амидгидролазами типа пепсина, химотрипсина, карбоксипептидазы и др. в тяжелокислородной воде (Н280), то наблюдается довольно быстрый обмен кислорода в карбоксильной группе субстрата [2183,21841:

18с

R-Cf" + Е\в0 -» R-Cf +• Н„0.

30Н

J1 18 Е 5°

V? + Н*80 ,*-- R-<

^ЗН 2 Ч18г 2

Специфичность ферментов в этой реакции также аналогична той, которая наблюдается по отношению к акцепторам транспептидации и к ингибированию гидролитических реакций продуктами [21851.

Константы скорости изотопного обмена обычно близки константам скорости гидролиза субстратов, содержащих ту же ациламинокислоту. Так, скорость кислородного обмена в ацетилфенилаланине, катализируемом пепсином, характеризуется константами (рН 2) fecat=0,014 с-1, KJ=8,4.10-3 М [21861, а гидролиз AcPhePhe - к .=0,015 с-1, К'=0,16.10_3 М [21871. Величина К. для АсРпе составляет 23-10 М (21871, т.е. довольно близка величине в реакциях изотопного обмена.

Было высказано мнение, что изотопный обмен происходит в результате реакции синтеза-гадролиза ациламинокислоты с некоторыми примесными пептидами, содержащимися в препаратах фермента, или (в случае карбоксипептидазы А) с продуктом отщепления ацильной группы [21881. Однако обмен кислорода катализируется иммобилизованным ферментом (пепсин), тщательно отмытым от приме-

204 Глава четвертая. Ферментативный гидролиз. Феноменология

сей низкомолекулярных веществ и не подвергающемся в ходе инкубации автоли-тическим реакциям [21891.

4.8.3. Енолизация кетонов, а р-элиминирование и др.

Было показано [2190-21921, что карбоксипептидаза А катализирует обмен водорода в а-СН2-группе кетонов - аналогов субстрата этого фермента:

D20(E)

Ме0-с^ОУс0СН2СНС00Н -> MeO-f^Q^ COCDgCHCOOH.

СН„С,

СН2С6Н5 СНгСбН5

Очевидно, что реакция идет через енольную форму кетона. Скорость этой реакции довольно низка (ftcat=3,7.10-4 с-1). Однако оценка каталитического эффекта карбоксипептидазы А в этой реакции показывает, что фермент ускоряет ее в 104-105 раз по сравнению с модельной реакцией енолизации ацетона в присутствии уксусной кислоты.

Карбоксипептидаза А [2193,21941, а также дипептидилкарбоксипептидаза [21951 катализируют реакции а,р-злиминирования в замещенных 7-кетокислотах:

О О

^QyC-CH(R1 )-?Н-СООН -» ^ОУс-СН=СН-?00Н,

i

где R = Н, СН,СЛ1С; Х= CI, SCJTNO -п.

Отщепление НС1 идет с константой скорости второго порядка ft /К =3300 -1 _1 с m-i -1

М с , тогда как катализируемый щелочью процесс идет с ftQH=0,18 М с

-[21941.

Наконец, еще в 1955 г. сообщалось о катализе химотрипсином гидролиза С-С-связи в этиловом эфире 5-(п-оксифенил)-3-кетоглутаровой кислоты с образованием п-оксифени.ппропионовой кислоты [21961. Однако подтверждения этим данным не последовало.

4.9. Заключение

Многочисленные амидгидролазы катализируют, за немногими исключениями, одну реакцию - гидролитическое расщепление амидной связи. Все многообразие этих ферментов обусловлено, главным образом, различием в специфичност

страница 31
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Химия протеолиза" (8.49Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
символы адвокатуры
вешалка напольная sheffilton, для костюма, габариты
цветочный дизайн обучение
курсы свадебных и вечерних причесок в москве

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(04.12.2016)