химический каталог




Химия протеолиза

Автор В.К.Антонов

-нитрофенилового эфира ацетилтриптофана, обусловлено общей для этого соединения и соответствующего метилового эфира лимитирующей стадией деацилирования ацилхимотрипсина. Для этой стадии ферментативного гидролиза расщепление n-нитрофениловых эфиров не является адекватной модельной реакцией.

Эффективность р-лактамазы находится в интервале эффективности других протеаз, хотя модельные р-лактамы гидролизуются в неферментативных условиях гфимерно в 100 раз быстрее, чем обычные амиды.

Сравнение эффективности различных амидгидролаз имеет, однако, относительную ценность, поскольку нет уверенности в том, что рассматриваемые сейчас субстраты являются наилучшими, а конгруэнтные модели действительно конгруэнтны. Важно отметить лишь, что амидгидролазы относятся к числу весьма эффективных ферментов, причем не исключено, что их эффективность определяется стадиями ассоциации и диссоциации соответствующих комплексов с субст-

13. В.К. Антонов

194

Глава четвертая. Ферментативный гидролиз. Феноменология

ратами или продуктами. Для сравнения отметим, что, например, каталаза, обычно рассматриваемая как пример одного из самых эффективных ферментов (йса1./К^=4.107 М-1с-1 [20503), лишь в 5.103 эффективнее модельного катализатора - гематина [2051].

На кривых распределения значений й , йса1/Кт и й1, полученных для большого числа ферментов [2041, с.70], данные для хороших субстратов амидгидролаз укладываются вблизи максимумов (рис.69).

рис.69. Плотности функции распределения lf(x)] констант скоростей лимитирующих стадий ферментативных реакций №oat)•

констант скоростей образования фермент-субстратных комплексов (Й ) и констант скоростей 2-го порядка (Й /К ) [2041]

Kt,KcallKvM 'с

Оценить относительную специфичность различных ферментов можно, сравнивая вероятности расщепления амидных связей в белках и пептидах [1956], т.е. отношение числа расщепляемых связей к общему числу связей в изученных последовательностях. Среди исследованных таким образом ферментов химотрипсин и пепсин относятся к наиболее специфичным:

Фермент Вероятность Фермент Вероятность

Химотрипсин 0,14 Эластаза 0,24

Пепсин 0,15 Папаин 0,26

Термолизин 0,18

Однако к таким оценкам следует подходить с осторожностью, поскольку они не учитывыют разную частоту встречаемости той или иной аминокислоты в последовательности белков.

Как уже отмечалось в разд.4.3.1.4, разные протеазы существенно отличают-ея по отношению к влиянию вторичных взаимодействий на катализ. Это относится не только к ферментам разных групп, но и к протеазам, входящим в одну и ту же группу, например химотрипсину и субтилизину BPN' или эластазе. С этой точки зрения последние два фермента более специфичны, чем химотрипсин, что противоречит приведенным выше данным [1956].

К сожалению, пока еще нет возможности сравнивать специфичность различных амидгидролаз безотносительно к выбранной серии субстратов, на основе критериев, изложенных в разд.4.3. Имеется большое число публикаций, в которых •сравниваются скорости гидролиза одного и того же или нескольких близких субстратов различными ферментами, принадлежащими к родственным- типам (см., например: (419,772,1827,1833,1847,1848,1863,1868,1904,2052- 2059]). Однако в целом оценка специфичности остается все еще довольно интуитивной.

4.6. Влияние модификации амидгидролаз на их активность

195

4.6. Влияние модификации амидгидролаз на их активность

Модификация ферментов может приводить к существенным изменениям их эффективности и специфичности. Это часто позволяет составить представление о роли тех или иных участков молекулы фермента в проявлении им каталитических свойств. Можно различать три типа модификаций: 1) протеолитическая модификация, т.е. отщепление (или присоединение) определенного фрагмента полипептидной цепи; 2) химическая модификация - введение в белок чужеродных фрагментов и группировок и 3) направленный мутагенез - замена одних остатков аминокислот на другие. Последний тип модификаций стал возможен в последнее время в связи с развитием техники рекомбинантных молекул и, несомненно, имеет большое будущее в отношении исследований связи структуры и активности ферментов.

4.6.1. Протеолитическая модификация

Следует, во-первых, рассмотреть те модификации, которые встречаются в природе, т.е. зимогены, различные формы активных ферментов, возникающие за счет неоднозначной активации или действия посторонних протеиназ.

Оказалось, что зимогены некоторых сериновых протеаз - химотрипсиноген и трипсиноген обладают заметной каталитической активностью [2060-2063] (табл.51).

Таблица 51. Активность зимогенов [2061] и соответствующих сериновых цротеаз

Белок BooGlyONp* ZSerGlyGlyONp* Й +, cat -1 с К .1С3, m М Й JK , cat m И"1о"1 fecat' о"1 'Я- .ю3, m М Й уя , cat m „-1 -1 М с

Химотрипсиноген 0,0077 2,7 2,85 0,0037 7,1 0,52

Химотрипсин 1,2 1 ,3 923 0,32 0,47 680

Трипсиноген 0,0036 3,4 1,05 0,004 6,3 0,63

Трипсин 1,2 1,45 0,47 5,8 81

*п-Нитрофениловые эфиры.

Как видно, различие в активности составляет 3-4 порядка, причем главным образом за счет снижения каталитической константы. Было показано [2062 3, что увеличение ионной силы раствора приводит к увеличению активности трип-синогена за счет уменьшения величины Я .

m

Были также обнаружены активные формы пепсиногена, образующиеся в процессе его активации при смещении рН из нейтральной'в кислую область (2064, 2065].

Как отмечалось ранее, активация зимогенов часто происходит неоднозначно, причем образуются разные формы ферментов, отличающиеся структурой N-конце-вой части молекулы или числом и структурой полипептидных цепей. Было отмечено, что разные формы активных протеаз могут отличаться по своим кинети-

196 Глава четвертая. Ферментативный гидролиз. Феноменология

ческим характеристикам [292,2066]. Формы химотрипсина с различным образом расщепленной С-цепью (6-химотрипсин, а^химотрипсин) отличаются от а-химотрипсина величиной Кт по отношению к сложноэфирным субстратам в щелочной области [2066]. Было показано также [1207], что формы а-, р- и 7-трипсина заметно различаются по кинетическим параметрам в отношении одного и того же субстрата.

Аналогичная картина наблюдается для тромбина. Активация протромбина фактором Va (в присутствии Са2+ и фосфолипида) приводит к а-тромбину, который может подвергаться автолизу с образованием р- и 7-тромбинов. Кроме того, могут образовываться другие формы - е, рт и др. Все они определенным образом отличаются по своим каталитическим свойствам [2067]. Было показано [2068], что р-цепь а-тромбина, будучи выделена в особых условиях, сохраняет до 5% каталитической активности.

Весьма сложным является процесс активации ренина. Проренин - неактивный белок с Мг«43 кДа быстро активируется с расщеплением связи Arg63-Ser64, образуя одноцепочечный активный фермент. Последний способен медленно превращаться в двухцепочечную форму с Мг»36,5 кДа путем выщепления остатков 355-356 [2069].

Двухцепочечный фермент энтеропептидаза при восстановлении дисульфидной связи образует каталитически активную легкую цепь, обладающую трипсинопо-добной специфичностью по активации трипсиногена. Однако активация в этом случае идет много медленнее и только при высоких значениях рН. Интересно, что соевый трипсиновый ингибитор, не способный подавлять нативную энтеро-пептидазу, эффективно реагирует с легкой цепью [2070]. Отмечалось также протеолитическое расщепление энкефалиназы [2071], калпаинов [2072] и плаз-мина (образование "микроплазмина" [2073,2074]), мало влияющее на свойства ферментов.

Интересным примером является действие субтилизина на термолизин [2075]. При этом отщепляется N-концевой тетрапептид и происходит расщепление по связи Thr224-Gln225. Образовавшиеся две цепи с Мг 24 и 10 кДа очень прочно ассоциированы. Такой термолизин S (по аналогии с РНКзой S) сохранает 3% активности нативного фермента.

4.6.2. Химическая модификация

Существует очень большое число работ по химической модификации ферментов, в том числе и амидгидролаз (см. обзоры: [163,2076-2080]).

Химическая модификация амидгидролаз обычно приводит к падению их каталитической активности за счет увеличения или уменьшения fccat- Однако некоторые модификации не приводят к снижению связывающих субстрат свойств фермента. Так, метилирование каталитически важного остатка HIs57 в химотрипси-не [1324] не влияет на способность связывать субстраты и ингибиторы [1325, 1326,2081,2082]. Каталитическая активность (Н1з57)-метилхимотрипсина, хотя и уменьшается примерно на пять порядков, все же сохраняется [1325]. Связывание субстратов сохраняется и в ангидрохимотрипсине. В некоторых цистеиновых протеазах удается заменить тиоловую группу в остатке цистеина активного центра на гидроксильную группу и в сериновых - гидроксил серина на тиоловую группу, получая искусственные ферменты [2083]. Оказалось, что тиол-

4.6. Влияние модификации амидгидролаз на их активность

197

субтилизин гидролизует n-нитрофениловые эфиры с более высоким значением fecat/Km' чем ксх°№ш^1 субтилизин [20843- Удалось получить также селенолсуб-тилизин [20853. Этот искусственный фермент более, чем на четыре порядка активнее в отношении ацилтрансферазных реакций, чем субтилизин.

Нередко химическая модификация изменяет соотношение между пептидазной и эстеразной активностью ферментов. Так, азосочетание а-химотрипсина с диазо-аналогом субстрата

С.НсССШСНС00СН,

6 5 I 3

происходящее по остатку Туг146, приводит к значительному увеличению амидаз ной активности (по SucGly3PhepNA) по сравнению с эстеразной (по AcTyrOEt) - соотношение констант скорости второго порядка для эфира и амида меняется с 300 у немодифицированного фермента до 50 - у модифицированного [20861.

Противоположные изменения наблюдаются [20871 при азосочетании (с диазо-Ш-тетразолом) и нитровании (тетранитрометаном) карбоксипептидазы А. Диазо-сочетание проходит по остатку Туг248 и приводит к увеличению эстеразной и к небольшому падению амидазной активности, а последующее нитрование остатка Туг198 не влияет на эстеразную активность, но существенно снижает амидаз-ную.

Отмечалось также увеличение амидазной активности карбоксипептидазы А и термолизина [20881 при химической модификации, однако специфическая модификация Туг248 в карбоксипептидазе А приводит к полной потере амидазной при сохранении эстеразной активности [12601.

Изменение специфичности трипсина наблюдалось [20901 при этилировании фермента триэтилоксонийфторборатом. Полученное производное теряло способность гидролизовать катионные субстраты и связывать специфические ингибиторы, но сохраняло и даже увеличивало способность связывать и гидролизовать нейтральные субстраты. Гидрофобизация химотрипсина увеличивает значение кг в 2,3 раза [20911.

Модификация может быть направлена на изменение устойчивости и растворимости фермента в органических растворителях. Так, модификация поверхностных аминогрупп химотрипсина и трипсина поликарбоновыми кислотами значительно увеличивает их стабильность к тепловой денатурации [2092], а введение в молекулу химотрипсина эфиров полиэтиленгликоля позволяет получить препараты, растворимые в трихлорэтане [20791.

В случае металлсодержащих амидгидролаз значительный интерес представляют изменения кинетических параметров в зависимости от характера металла, присутствующего в активном центре. Ион Zn2+ в карбоксипептидазе А может быть заменен на ион Со2+ [20931- При этом наблюдается значительная активация фермента: значение к /К для гидролиза ZGlyGlyPhe возрастает с 4.105

— 1—1 Р+ сат m с; —1 —1

М с для Zn -фермента до 9,4-10 М с (за счет * t) [17381. Аналогичная активация наблюдалась для аминопептидазы из Bacillus subtllls (20941 и Aercmonas sp. [2095].

Обычно углеводы, входящие в состав амидгидролаз, не оказывают какого-ли-

198

Глава четвертая. Ферментативный гидролиз. Феноменология

бо эффекта на их специфичность или каталитические свойства. Однако имеются исключения из этого правила. Так, различные дрожжевые карбоксипептидазы Y, отличающиеся по углеводному составу, имеют разные кинетические характеристики [20963.

Было отмечено [1917,2097-20991, что гликозилирование многих белков происходит в местах 6-изгибов полипептидной цепи. Именно эти участки являются наиболее уязвимыми в реакциях ограниченного протеолиза. Вероятно, поэтому гликозилирование защищает белки от неспецифического расщепления протеазами. Это представление получило некоторое экспериментальное подтверждение [21003.

Следует также отметить различия в специфичности, наблюдающиеся у разных форм субъединичных амидгидролаз. Аминопептидаза из Bacillus stearothermo-phllus API состоит из двенадцати субъединиц аир, входящих в различные формы фермента в разном соотношении. Гидролиз пептидов, содержащих остатки Asp и Glu, происходит лишь полными формами фермента, тогда как изолированные а- и р-субъединицы гидролизуют нейтральные пептиды [юн].

4.6.3. Направленный мутагенез

Известен ряд примеров различной активности природных мутантных форм некоторых амидгидролаз [1195,2101-2103]. В случае точечных мутаций появляется возможность сравнивать свойства ферментов, в которых произошла замена одной аминокислоты на другую. Однако эти возможности были весьма ограниченны, пока не была разработана техника направленного мутагенеза (см. обзоры: [2104, 2105]). С тех пор работы по направленному мутагенезу ферментов стали нарастать лавинообразно (см.: [2106-211 о]). Это направление получило название белковой инженерии ферментов и успешно используется для выявления связи их структуры и функции.

Наиболее широко этот метод был использован для исследования субтилизина с целью получения фермента, устойчивого к окислению [2111] и к тепловой денатурации [2112-2115], для изменения рН-оптимума фермента [2116], выяснения роли отдельных остатков в области активного центра в специфичности фермента [2117-2121] и, наконец, для подтверждения механизма стабилизации переходного СОСТОЯНИЯ [2122].

Окисление Met222 приводит к значительному снижению активности субтилизина. Была произведена замена этого остатка на 19 других аминокислот. Оказалось, что замена на нейтральные аминокислоты лишь немного сказывается на активности, тогда как введение заряженных остатков снижает активность в 200-300 раз. Ферменты, содержащие вместо Met222 остатки других нейтральных аминокислот, устойчивы к окислению. Были предприняты попытки увеличить термостабильность субтилизина введением одной или двух дисульфидных связей в положения 22-87 или 24-87; как оказалось, это не приводит к увеличению тер-мо- и автолитической стабильности [2112]. Образовавшаяся S-S-связь лежит на поверхности и имеет необычную напряженную конформацию [2113]. Обширные исследования различных типов S-S-содержащих субтилизинов не выявили связи между наличием и положением дисульфидных мостиков и устойчивостью фермента [2115].

Замены в субтилизине BPN' остатков Asp99 на Ser или Glu156 на Ser и др.

4.6. Влияние модификации амидгидролаз на их

страница 30
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Химия протеолиза" (8.49Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
курсы на валютного касира
Best-Fiesta SHADOW
шоу филиппа я в кремле 2016 год
компания перевозки гироскутера на самолете

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(04.12.2016)