химический каталог




Химия протеолиза

Автор В.К.Антонов

2021].

Инверсия стереоспецифичности соединения (1) (табл.48) обусловлена, как оказалось [2021,2022,2026], тем, что в своей экваториальной форме (20271 оно конформационно совпадает с эфиром Н-ацетил-?-фенилаланина (рис.66).

Рис.66. Возможное взаимное расположение С-З-кар-боетоксидигидроизокарбостирила и ефира N-ацетил-i-фенилаланина в активном центре а-химотрипсина [2029]

188 Глава четвертая. Ферментативный гидролиз. Феноменология

Аналогично ведет себя в отношении гидролиза этого соединения субтилизин

[2028].

Результаты анализа конформации субстратов с ограниченной конформационной подвижностью, а также других типов "закрепленных" субстратов [1775], например

СО ч0

С0/''

позволили составить представление о конформации типичных субстратов а-химотрипсина в активном центре фермента [2029].

Влияние вторичной стереоспецифичности на кинетические параметры ферментативного гидролиза обычно слабее, чем влияние первичной стереоспецифичности, и зависит от степени удаления остатка с D-конфигурацией от расщепляемой связи (табл.49). Следует отметить, что стереоспецифичность протеаз практически исчезает, если реакцию проводить в неводных растворителях [2032].

Таблица 49. Влияние D-конфигурации аминокислотного остатка, удаленного от расщепляемой связи, на кинетические параметры гидролиза

Фермент Субстрат (Й JK )т cat mi Литературный

(Й УК )п s cat m и источник

а-Химо-трипсин V АсЪеиТутОМе Ac-D-LeuIyrOMe 2,9-10*? 1,9-10* 152,6 [2030]

Трипсин BzPheValArgpNA Bz-D PheValArgpNA 2,96-10^ 9,42-10* 3,14 [1808]

BocAlaLysOMe Boc-D-AlaLysOMe 1 ,2-10*? 7-104 17,1 [1865]

Тромбин BocAlaLysOMe Boc-D-AlaLysOMe 4,2-10Л 55,9 751 [1865]

Эластаза AlaAlaPhe-AlaAlaAla D-AlaAlaPhe-AlaAlaAla V 3,6-10* 1 ,1 -10* 3,27 [1871 ]

Субтилизин BPN' ZAlaAlaLeuNH^ Z-D-AlaAlaLeuNH0 V 2 1 ,14-Ю3 13,75 82,9 [1846]

Папаин AcPheGlupNA Ac-D-PheGlupNA 2,04-Ю3 5,9 330 [2031]

Термолизин ZGlyLeu-GlyAla ZGlyLeu-Gly-D-Ala 3,08-10* 1,86•10 16,5 [1888]

Пролидаза ZGlyPro-Ala ZGlyPro-D-Ala 1 ,95-Ю^ 6,08-10 32 [1893]

Протеазы специфичны не только к конфигурации асимметрического центра, но и к геометрии пептидной связи или двойной связи в субстрате. Так, было показано [1896,2033,2034], что пролидаза и другие пролинспецифичные ферменты способны расщеплять только транс-форму амидной связи.

Чг±о касается химотрипсина и трипсина, то эти ферменты способны расщеплять субстраты, содержащие остатки цис-пролина в положениях Р2 и более удаленные от гидролизуемой связи, однако трипсин не гидролизует субстраты с

Цис-Рго В ПОЛОЖеНИИ Р2 [2035,2036].

4.3. Специфичность

189

Было показано [2037,2038], что тракс-циннамоилхимотрипсин деацилируется со значительно более высокой скоростью, чем его цис-изомер. На этом основаны попытки использования этого фермента в бессеребряной фотографии [20391.

Следует отметить, что ряд ферментов не обладает выраженной стереоспеци-фичностью. Например, аспарагиназа II из дрожжей гидролизует как D-, так и Ь-аспарагин [658].

Конформщишная спешфачность. чувствительность пептида к действию про -теолитических ферментов может определяться его конформацией.

Для гидролиза нативных белков, конформационная подвижность которых невелика, этот тип специфичности может иметь определяющее значение. Если же субстрат конформационно подвижен и переход между конформациями (S1 и S2) определяется константой равновесия К

К

S1 S2, где K=[S21/[S11, то скорость гидролиза одного из конформеров (например, S2) будет

ftg[Elo[S]o

v = -, где [SI =[S01+[S. 1.

К (1+й)/К + [S] о 2 1

б о

Таким образом, чем сильнее равновесие будет сдвинуто в сторону негидро лизуемого конформера, тем выше будет значение К^, но наличие конформацион-ного равновесия не будет влиять на величину й ' .

4.3.4. Соотношения между каталитическими константами и константами михаэлиса

Специфичность амидгидролаз может проявляться как в величине максимальной скорости (У =й . (Е1 ), так и в связывании (К ). Кроме того, возможно по-ложение, когда в ряду субстратов увеличивается константа скорости одной из стадий (а также й t) и уменьшается наблюдаемая константа диссоциации фермент-субстратного комплекса (#а), т.е. соблюдается принцип "лучшее связывание - лучший катализ" [1962]. Наконец, непродуктивное связывание может приводить к уменьшению как й t, так и Кт ("лучшее связывание - худший катализ" ).

Анализ таких зависимостей для большого числа субстратов ряда протеаз показал (2040], что существует определенная взаимосвязь между значениями й и К^, проявляющаяся особенно для однотипных субстратов (например, пептидов), имеющих сходную или одинаковую группировку, определяющую первичную специфичность фермента [17151. Эта зависимость выражается в том, что для серии субстратов увеличение й сопровождается лишь незначительным изменением до тех пор, пока значения й t не превысят некоторую, характерную для данного фермента, величину, после чего наблюдается тенденция к постоянству й и уменьшению К\ Иными словами, наблюдается переход от проявления специфичности в максимальных скоростях к ее проявлению в связывании субстрата (рис.67).

Такие соотношения й и К^, по-видимому, сложились в ходе эволюции ферментов. Для обеспечения наибольшей скорости гидролиза субстрата при посто-

190

Глава четвертая. Ферментативный гидролиз. Феноменология

iq(KjK&)

_I_I_I_I_I_L

-10 1 г з « 5

рис.67. Связь между относительными значениями К и относительными m

значениями &cat в сериях субстратов карбоксипептидазы ), химотрипсина (г) и пепсина (з) [2040]

Субстрат: 7- Ac-X-Phe [1738],

г- Ac-X-Phe-Y [1858,1859],

3- Z-X-Phe (N02 )Phe-Y [1878,1907'].

X - аминокислотный остаток "или пептид; Y - С-защитная группа или пептид

янном и максимальном значении й и постоянной концентрации субстрата

выгодно иметь высокие значения (так, чтобы 8^>[S] ) [1613, с.304], и в этом случае наибольшая скорость будет достигаться увеличением й t. Однако эта величина, по-видимому, не может увеличиваться сверх определенного пре-дела, зависящего как от структуры расщепляемой связи, так и от типа каталитического аппарата фермента. Поэтому дальнейшая максимизация скорости будет достигаться уменьшением К^, т.е. улучшением связывания субстрата-. Более детально следствия наблюдаемых соотношений feoa4 и К^, будут разобраны в гл.8.

Следует отметить, что сходные соотношения кинетических констант наблюдаются не только для гидролитических, но и для других типов ферментов [2041, С.72].

Соотношение "лучшее связывание - лучший катализ" выполняется для^некоторых протеаз в серии субстратов, различающихся Р -остатком. Так, для*эфиров ациламинокислот была предложена [2042] линейная зависимость, связывающая величины й2 и Кд в гидролизе химотрипсином:

lgft2 = С + раох + рКе,

где С - константа, ра и ох - параметры уравнения Гаммета, а фа и фь - величины чувствительности субстрата к изменению гидрофобности (%) на стадии ацилирования и связывания.

4.4. Эффективность

Если специфичность фермента выявляется при сравнении скоростей превращения в серии субстратов, то, чтобы оценить его эффективность, необходимо сравнить скорость превращения субстрата, катализируемого ферментом, со скоростью в модельной, неферментативной реакции. Здесь возникает несколько проблем.

Во-первых, это проблема выбора модельной реакции. Косовер (20431 ввел представление о конгруэнтной модельной реакции, т.е. такой неферментативной реакции, которая идет через те же самые или очень сходные промежуточные со-

4.4. Эффективность

191

единения, ято и ферментативная реакция. Таким образом, выбор конгруэнтной модели подразумевает знание механизма как ферментативной, так и модельной реакции. 1На современном уровне наших знаний это не всегда можно сделать однозначно. Для гидролитических реакций, катализируемых четырьмя известными группами амидгидролаз, наиболее близкими конгруэнтными моделями, очевидно, являются реакции, катализируемые низкомолекулярными веществами, природа которых сходна с природой каталитически активных групп фермента, т.е. ионами R-S- и R-СГ, карбоксилат-ионом и ионом металла. Однако и здесь возникают проблемы, связанные, например, с концентрацией каталитически активной формы нуклеофила в ферменте.

Во-вторых, это проблема выбора сравниваемого кинетического параметра. Модельные и ферментативные реакции различаются молекулярностью. Первые -обычно реакции второго порядка, тогда как скорость ферментативного процесса зависит только от концентрации фермент-субстратного комплекса. Очевидно, что сравнивать лучше всего константы одинакового порядка, например константу скорости второго порядка модельной реакции №он, йБН и т.д.) и константу скорости второго порядка №cat/Km) ферментативной реакции. В то же время представляет интерес сравнение величины константы скорости второго порядка для модельной реакции и й фермента. Такое сравнение дает величину эффективной концентрации субстрата, при которой скорость его превращения в продукт равна скорости ферментативной реакции.

Следует помнить, что величины йса1./Кт, &cat и Кт могут быть эффективными величинами, не характеризующими скорость или равновесие на какой-либо стадии процесса, а являющиеся комбинацией констант скоростей отдельных стадий (см. разд.4.1.3). Кроме того, и константа скорости модельной реакции может быть эффективной величиной, если существует равновесие нескольких различающихся по реакционной способности форм субстрата. Эта проблема будет подробнее рассмотрена в гл.8.

Наконец, трудным вопросом при определении эффективности ферментативного катализа является выбор субстрата. Скорость модельных реакций мало зависит от структуры субстрата (для одинаковых расщепляемых связей), тогда как скорость ферментативной реакции может меняться на 5-7 порядков при изменении структуры даже удаленных от расщепляемой группы участков молекулы.

Что касается протеолитических ферментов, поскольку их природными субстратами являются часто белки, то для определения эффективности следовало бы выбирать именно эти субстраты. Однако очень трудно определить скорость гидролиза одной амидной связи в таком биополимере не только в неферментативной, но,и в ферментативной реакции. В табл.42 igj.'4""^ приведено несколько примеров таких реакций. 3 3 Во многих случаях скорости гидролиза белков не ^^^о-

Рис.68. Зависимость -нормализованных констант скорости деацилирования ацилхимотрипсинов от величин сродства к ферменту соответствующих амидов ГГ-ацетил-С-аминокислот [3405]

очень велики.

-J

-1

о

-ЦК; (Л)

192

Глава четвертая. Ферментативный гидролиз. Феноменология

Обширный экспериментальный материал имеется по гидролизу синтетических пептидов. Определение эффективности на основе этих данных наиболее правильно при "насыщении специфичности", т.е. при использовании субстратов, максимально быстро превращающихся данным ферментом. Следует учитывать, что в каждом ряду субстратов может быть свой уровень "насыщения". Например, скорости деацилирования ацилхимотрипсинов стремятся к пределу в ряду ацильных остатков с увеличивающейся гидрофобностью боковой цепи, достигая максимального значения в случае N-ацетилтриптофанилхимотрипсина (рис.68).

Сравнение скоростей катализируемых амидгидролазами реакций гидролиза со скоростями соответствующих модельных реакций показывает, что эффективность этих ферментов составляет 107-1012 (табл.50).

Возникает вопрос, какова может быть предельная скорость реакции при ферментативном гидролизе? Очевидно, что в простейшем случае двухстадийного ферментативного процесса

Таблица 50. Эффективность некоторых амидгидролаз

Фермент Субстрат fecaf 0"1 к .ю3, m M Й ./к , cat m М-1с"1 й . * cat К Й m п Литературный источник

Химо- FaTrpOMe 27,1 4,1 -Ю-3 6,5 107 1.3-109 [2044]

трипсин AcTrpONp 30,5 2-Ю-3 1,5 107 2,7-Ю6 [1761 ]

AcProAlaProPhe-PheNH , 8,0 0,21 3,8 104 1,15-Ю8 [1841 ]

Субти- AcGlyGlyPhe(N0„)0Me 1,35-10 5 48,5 2,8 10б 5,5-Ю7 [2045]

лизин

Карлс-

берг

Термо- Ас(А1а)*0Ме 2,05-Ю3 1,5 1 ,36 10б 2,7-Ю7 [381 ]

миколин

Папаин ZGlyValGlu-Leu-Gly 8,9 2,9 3,1 103 5,1 -1012 [1819]

Пепсин ZAlaAlaPhe-PheOpp 282 0,04 7 10б 4.8.1011 [1878]

Со2+- ZGlyGly-Phe 283 0,3 9,4 ю5 3,1 -1010 [1738]

карбок-

сипеп-

тидаза А

Карбок- BzAla-Arg 426 0,086 4,9 10б 1 ,65-Ю11 [2046]

сипеп-

тидаза

Б (че-

ловека )

6-Лак- Бензилпенициллин 2000 0,02 1 ю8 1,1 .ю9 [1856]

тамаза 3,4-Ю12

Ренин Ангиотензиноген 50 0,001 5 ю7 [923]

"Константы скорости неферментативного гидролиза (Й , М" 1 с 1) приведены в табл. 26 и 29, а также в работах [1533,1570]. п

4.5. Сравнение эффективности и специфичности амидгидролаз 193

Е + S

ES

Е + Р

общая скорость реакции будет определяться значениями й1 и й2 и не может быть выше, чем одна из них. При увеличении константы й„ величина к ./К = fe^g/Cft +й?) будет стремиться к й1 и достигать этого значения при й2>>й_1 [2047]. Таким образом, йса1/Кт не может быть выше, чем й1. В свою очередь значение й лимитируется скоростью диффузии и для белок-лигандных взаимодействий нэ превышает величины 1-Ю9 М_1с~1 [1733]. Отсюда следует, что и константа скорости второго порядка не может быть выше этого значения.

Как видно из табл.42 и 50, для некоторых катализируемых амидгидролазами реакций скорость приближается к диффузионно контролируемому лимиту. Были получены [2048,2049] прямые подтверждения тому, что скорость ферментативной реакции может контролироваться диффузией. Изучение [2048] зависимости величин йоа1/Е для гидролиза бензилпенициллина (2,35-107 М-1с-1) и цефалориди-

на (1-104 М~1с-1), катализируемого р-лактамазой от вязкости среды показало, что увеличение вязкости (т.е. снижение скорости диффузии) влияет на гидролиз бистро гидролизуемого субстрата и не влияет на медленный субстрат. Прямое определение к для этих субстратов дало значение порядка 1,7-107 М-1с"1.

4.5. Сравнение эффективности и специфичности амидгидролаз

Эффективность амидгидролаз превосходит эффективность соответствующих модельных катализаторов в 107-1012 раз. Сериновые протеазы тяготеют к нижнему пределу этого интервала, тогда как аспартатные и металлсодержащие - к верхнему пределу. Несмотря на относительно невысокое значение koat/Km для папа-I ина - представителя цистеиновых протеаз, его эффективность одна из самых высоких за счет низкого значения каталитической эффективности тиолов в гидролизе амидов. Интересно отметить, что эффективность сериновых протеаз в /общем мало зависит от типа расщепляемой связи.

Отклонение, наблюдаемое для n

страница 29
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Химия протеолиза" (8.49Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
акустика на прокат
Фирма Ренессанс: стекло для лестниц - качественно и быстро!
кресло 868
кладовка для хранения вещей лыж бытовой техникив квартире 1.5 на 2 м

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(10.12.2016)