химический каталог




Химия протеолиза

Автор В.К.Антонов

м производных коричной кислоты показывают, что это действительно наблюдается на стадии деацилирования, но не наблюдается при ацилировании фермента (табл.45).

Таблица 45. Константы щелочного и катализируемого химотрипсином гидролиза производных коричной кислоты [1987]

Субстрат \, сГ1 V 0-1 Ьш, М-1 с"1

СбН5-СН=СН-С00Ме С,НсСНо-СНоС00Ме о о С- с. 0,028 0,02 0,0125 0,18 1,19 7,7

Ацилферменты, содержащие ненасыщенные ацильные группы, заметно отличаются по спектральным свойствам от соответствующих модельных соединений - наблюдается значительный сдвиг максимума поглощения в длинноволновую область (1984-1986).

Влияние щиламиногруппы. Изменение характера ациламиногруппы в субстратах химотрипсина типа

Н

R-C-C0X NHCOR1

также сказывается на наблюдаемых величинах кинетических констант. Удаление всей этой группировки приводит к снижению как величины й2> так и величины &3, тогда как значения Кд практически не изменяются.

Замена группы NH на атом кислорода или ее метилирование также приводит к резкому снижению каталитических констант (табл. 46).

Замена ацетаминогруппы в метиловом эфире ацетил-1-фенилаланил-1-фенил-

Таблица 46. Кинетические параметры катализируемого химотрипсином гидролиза соединений С.Н_СН„СН-С00С„Н_

о О С. | с Ь

X

X R +, с"1 oat й'.ю3, и т k3, с"1 К -103, 3 М Литературный источник

н 0,15 0,69 0,67 0,2 3,0 [1965]

ососн3 0,6 23 [1988]

N(CH3)C0CH3* 0,023 7,5 0,026 0,25 8,4 [1989]

NHC0CH3 96,5 0,9 800 110 7,6 [1965]

"Производные тирозина.

182 Глава четвертая. Ферментативный гидролиз. Феноменология

аланина на ацетоксигруппу полностью лишает полученное соединение способности гидролизоваться в присутствии пепсина, однако значение константы ингиби-рования. пепсина этим веществом совпадает с Кт исходного субстрата [1990].

Следует отметить, что негативная роль ацетоксигрупгш может быть "компенсирована" вторичными взаимодействиями. Так, карбоксамидометиловый эфир аце-тилглицил-Ь-фенилмолочной кислоты

ch3conhch2coochcooch2conh2 сн2сбн5

гидролизуется химотрипсином с более высокой скоростью, чем метиловый эфир N-ацетилфенилаланина <.^cat=^ с"1, Ят=0,5 мМ) [1991].

Ациламиногруппа вносит практически постоянный, не зависящий от типа ациламинокислоты вклад в ускорение реакции химотрипсином. На стадии деацилирования хорошо выполняется соотношение [1992]:

lgft3(NHC0CH3) « lgft3(H) + 2,4, (51)

т.е. константа скорости деацилирования увеличивается при переходе от не содержащих ациламиногрупп субстратов к содержащим эту группу примерно в 250 раэ.

Увеличение гидрофобности R1 в ациламиногруппе ¦ приводит к уменьшению величины Ке и й2 так, что соответствующие корреляционные уравнения имеют примерно одинаковый угловой коэффициент, но с разным знаком [1964, с.135]:

lgft2/Ks = (0,6±0,1)% + const, (52) lgfe2 = -(0,7+0,1 )ic + const. (53)

В то же время константа скорости деацилирования (й3) практически не зависит от гидрофобности остатка R1 [1970].

Симбатное изменение й2 и Кд скорее всего свидетельствует об увеличении степени непродуктивного связывания при увеличении гидрофобности ациламино-группы (см. разд.4.1.4).

Интересные данные были получены [1992] при анализе температурной зависимости констант й3 для серии содержащих и не содержащих ациламиногруппу суб-

Рис.бО. Зависимость енталыши активации реакции деацилирования ацилхимотрипсинов - производных N-ацетиламинокислот (а) и нормальных алифатических карбоновых кислот (б) от энтропии активации [1992]

R=CH3 (;); С2Н5 (2); Н-С3Н7 (3); н~СбН13 (4);

(а);

R-CH- С NH V

с(о)сн3

Н (5); Н-С4Нд (б); H-Cj-H^

(7); СН2С6Н5

СН2СбН40Н-?г (скорости реакции измерены

методами рН-статирования (J) и спектрофото-метрии (II)

¦20

-15

-10 AS*, э.е.

4.3. Специфичность

183

стратов химотрипсина. Как видно из рис.60, реакция гидролиза субстратов, содержащих одинаковую боковую цепь, но отличающихся наличием ациламиногруп-пы, протекает с практически одинаковой энтальпией активации и в то же время с сильно различающимися энтропиями активации. Таким образом, ациламиногруп-па вносит, по-видимому, энтропийный вклад в ускорение гидролиза специфических субстратов химотрипсина.

Заместители при а-С-атоме. Замена атома водорода при а-С-атоме производных ациламинокислот на более объемистые группировки приводит к полной потере субстратных свойств [1993,1994]. Однако относительно небольшие группы, введенные в а-положение, все же не препятствуют гидролизу [1995].

Уходящая группа и тип расщепляемой связи. Характер уходящей группы имеет решающее значение в реакционной способности производных карбоновых кислот по отношению к данному нуклеофилу. В ферментативном катализе роль основности уходящей группы может маскироваться ее взаимодействием с ферментом. Для большого числа неспецифических и так называемых полуспецифических субстратов (эфиров, анилидов и некоторых других производных ациламинокислот) зависимость скорости ферментативного катализа от рКа уходящей группы исследовалась весьма интенсивно, причем в случае катализа химотрипсином (1478,1534, 1996-гоог] и пепсином [2003-2005] были получены противоречивые данные. По-видимому, линейная зависимость рйа уходящей группы и константы скорости ферментативного гидролиза № t) наблюдается лишь в относительно узком интервале значений рКа (рис.61). В целом же для химотрипсинового катализа такая зависимость отсутствует [2000,2001].

Влияние гидрофобности уходящей группы на катализ химотрипсином гидролиза алкилацетатов было исследовано в реакции переноса ацетильной группы на спирты в процессе гидролиза гг-нитрофенилацетата [2006]. Было показано, что скорость переноса коррелирует с гидрофобностью с угловым коэффициентом, близким к единице, лишь для ограниченного числа спиртов (от этанола до бу-танола). Другие спирты подчиняются в этой реакции корреляционным зависимостям с другими угловыми коэффициентами (см. также: [2007]).

Чем же обусловлено значительное различие в скоростях гидролиза амидов и сложных эфиров при катализе сериновыми протеазами? Оказалось [2008-2010], что скорость ферментативного гидролиза различных производных одной и той же ациламинокислоты линейно связана с величиной изменения стандартной свободной энергии реакции (рис.62). Такая зависимость является проявлением известного постулата Хэммонда (см. разд. 3.4.3), в соответствии с которым,

m

РИС.61. Зависимость константы скорости 2-го порядка от рКа уходящей группы при гидролизе

ос-химотрипсином субстратов типа АсТутХ [2001 ]

6 -

Заместитель (X): 0С2Н~5 (;), MHCgH^NOg-n. (2),

шсбндда2-л1 (з), ынсбн4с1-л1 (л),

NHC6H4Cl-n (5), ЫНСбН40СН3-Л1 (б), ЫНСбН40СН3-тг (7), HHCgH^CHg-n (в), ЫНСН(СН3)С0ИН2 (9), NHOH (10), NHCH2C0NH2' (;;), NHM^ (72), ЫН2 {13), NHCH3 (14)

Z

3

z

• 3 ч S 7 W.

О

В В •

/2

• 13

-2

г ч в в w рк

184 Глава четвертая. Ферментативный гидролиз. Феноменология

-4fit ккал/моль

6

5 1 3

г

ЗУ

РИС.62. Зависимость изменения стандартной свободной енергии гидролиза и константы скорости 2-го порядка катализируемого химотрипсином гидролиза [2009]

Субстраты типа AcPhe(N0 -п)-Х

Заместитель (X): NHC6H4N02-n (3), NHC6H5 (4), NH?

ос2н5 (;), осн3

[2), [5),

NHNH„

(б), NHCH2C0NH2

(7), NHCH(CH3)C0NH2

{в)

О 1 2 3 Ч 5 6

чем выше энергия исходного состояния в мономолекулярной реакции, тем ближе структура переходного состояния к этому исходному состоянию. Другими словами, при прочих равных условиях химотрипсиновый катализ идет тем эффективнее, чем менее стабилизированной является расщепляемая связь. Различие в скоростях гидролиза эфиров и амидов обусловлено исключительно структурой расщепляемой связи, а не особенностями фермент-субстратного взаимодействия.

Указанная корреляция справедлива для "полуспецифических" субстратов, т.е. таких, уходящая группа которых заметно не взаимодействует с ферментом. Эта корреляция может быть описана эмпирическим уравнением:

-aG = 0,931 fiTln-

cat

+ 1,616

[г=0,999).

(54)

Однако, специфические субстраты, например Н-ацетил-п-нитрофенилаланил-1-аланиламид, выпадают из нее, поскольку остаток аланина эффективно взаимодействует с активным центром фермента [2011].

Для других ферментов имеется слишком мало данных по скоростям гидролиза в сериях различных производных ациламинокислот. Линейная зависимость скорости и свободной энергии, по-видимому, выполняется для карбоксипептидазы А [2012], тогда как для пепсина различия в скоростях гидролиза амидных и сложноэфирных (депсипептидных) субстратов очень невелики [2013].

ZTrp0C6H4N02-n; 2- ZTrpOCgH^COMe-n;

ZTrpOCgH^Cl-тг; 4-

ZTrpOCgH^OMe-n.;

;-

5- AcTyrOMe; б- АсТгрОМе; 7- AcTrpOEt; 8,9- AcPheOMe; 10- BzTyrNHCgH^NO^n;

BzTyrNHC6H4N02-jll; AcTyrNHC6H4N02-n; AcTyrNHCgH^Cl-jll; AcTyrNHC6H40Me-jll; AcTyrNHCgH^OMe-p;

BzTyrNHCgH^NO -

AcPheGlyNH. AcTyrNH2;

2'

24-

12 14-16-18

20- AcTyrGlyNH.

22

AcTyrNHCH,

AcTyrNHC6H4N02-^; AcTyrNHCgH^Cl-n; АсТугШСбНдСН3-тг;

2"

AcPheNH2;

Рис.63. Зависимость lg(ftoat/K ) от pKg уходящей группы в реакциях химотрипсина со специфическими субстратами [1405]

4.3. Специфичность

185

Изучение влияния структуры уходящей группы на химотрипсиновый катализ ([1405, с.388]) привело к выводу о том, что изменения рКа этой группы сопровождаются изменением механизма реакции и стадии, определяющей скорость. Поэтому в широком интервале рА"а зависимость константы скорости от основности уходящей группы имеет сложный криволинейный характер (рис.63).

Вторичная специфичность и структура субстратов. Имеется очень немного публикаций, в которых количественно прослеживается связь структуры удаленных от расщепляемой группы остатков и скорости ферментативного катализа. На качественном уровне исследована зависимость скорости расщепления В-цепи инсулина, а также трипсиногена карбоксильной протеазой из Aspergillus saltot

[880].

Интересные данные были получены [2014] в отношении вторичной специфичности гидролиза химотрипсином эфиров и амидов трипептидов. Оказалось, что уменьшение гидрофобности остатка в-положении Р2 увеличивает скорость гидролиза эфиров и уменьшает скорость гидролиза амидов (рис.64).

Рис.64. Зависимость относительных скоростей катализируемого химитрипсином гидролиза ефи-ров (V ) и амидов (V"2) от гидрофобности боковой цепи в положении Р2 для соединений типа RTyrOEt и РЛ?угШ2 [2014]

Заместитель (R): Ас (;), GlyGLy (г), GlyAla (3), GlyVal (л), GlyLeu (5), GLyNle (б)

г я

Было также исследовано влияние вторичной специфичности ацилдипептидов на связывание их химотрипсином и на положение равновесия в реакции ацилирова-ния этими дипептидами фермента [2015]. Оказалось, что для серии соединений общей формулы АсХ-ТгрОН, где X = Gly, Ala, Val, Leu и Phe, связывание химотрипсином (~uGq) линейно увеличивается при увеличении значения % для остатка X, тогда как положение равновесия реакции ацилирования не зависит от гидрофобности этого остатка.

4.3.3. Стереоспецифичность

Подавляющее большинство амидгидролаз проявляет стереоспецифичность, т.е. катализирует гидролиз лишь одного энантиомера асимметрического субстрата MS) или D(R):

СОХ... I сох... 1

I с 1 с

""1чв

н н

?(5)-форма С(Д)-форма

Очевидно, что стереоспецифичность будет проявляться в том случае, когда субстрат взаимодействует с ферментом по крайней мере тремя группами, окружающими асимметрический атом [2016]. Слово "взаимодействие" здесь не обязательно означает связывание, но может означать наличие пространственных за-

186

Глава четвертая. Ферментативный гидролиз. Феноменология

труднений для вхождения какой-либо группы в данный участок активного центра фермента.

Для протеаз можно различать первичную и вторичную стереоспецифичность в соответствии с влиянием на скорость гидролиза стереохимии аминокислотного остатка, образующего расщепляемую связь, и остатка, удаленного от этой связи.

Первичная стереоспецифичность большинства протеаз не проявляется в связывании субстрата. Так, значение К( (Кт) комплексов а-химотрипсина с D-энантиомерами производных ациламинокислот даже несколько меньше, чем величины Кт для комплексов с I-энантиомерами (табл.47) (2017,2018]. Не сказывается на связывании также изменение конфигурации у остатков, удаленных от расщепляемой связи в пептидной цепи.

Таблица 47. Кинетические параметры химотрипсинового гидролиза n-нитрофениловых эфиров бензилоксикарбониламинокислот [2017]

Субстрат 63(b) ft ./К (I) cat m

k3iD) ft ./К (D) cat mv

ZAlaONp 0,5 2,41 33,8 14,1

ZButONp 1,0 0,9 76,8 83,8

ZNvlOMp 1,5 0,84 54,7 64,6

ZLeuONp 2,42 1 ,98 75,5 38,1

ZPheONp 2,65 1 ,26 216 171

Изменение конфигурации а-С-атома у N-ациламинокислот влияет как на константу скорости деацилирования соответствующих ацилхимотрипсинов, так и на константу скорости второго порядка (6cat/Km). В зависимости от характера уходящей группы влияние стереохимии субстрата может быть очень значительным (для амидов, метиловых эфиров) и относительно небольшим (для нитрофениловых эфиров) [2019].

Как видно из данных табл.47, увеличение гидрофобности боковой цепи субстрата .в целом приводит к увеличению отношения констант L- и ?>-изомеров. Однако- это отношение уменьшается при увеличении гидрофобности заместителя в Ы-ациламиногруппе (рис.65). Таким образом, D-энантиомеры ведут себя в отношении зависимости от характера заместителя прямо противоположным по сравнению с I-изомерами образом.

Очевидно, что эти соотношения являются следствием увеличения степени непродуктивного связывания при взаимодействии фермента с Д-энантиомерами по сравнению с Б-соединениями.

Рис.65. Зависимость констант скоростей ацили-рования в реакциях химотрипсина с метиловыми эфирами N-ацилпроизводных D-аланина от гидрофобности N-концевой группы субстрата [1970]

Ацильные группы: тетрагидрофурил (7), тиофенил (2), бензоил (з), о-аминобензоил(4), никотинил (51), изоникотинил (б), ацетил (7)

4.3. Специфичность

187

Таблица 48. Обращенная стереоспецифичность химотрипсина к субстратам с ограниченной конформационной подвижностью (рН 7

,8)

Номер

Соединение

Конфигурация

Заместитель

Я'. 10 , М

m

Литературный источник

СОХ

сох

сох

сох

ох

D ОМе 20,0

L ОМе 0,12

D** ONp 2,6

D ОМе 56,0

L ОМе 1,8

s R

d L

ONp ONp

ОМе ОМе

ОМе ОМе

ONp - n-нитрофениловый эфир. "рН 6,0.

3,3 0,072

0,006 0,002

0,22 0,024

0,98 12,7

0,018

2,5 28,0

0,0045 0,0033

11 ,2 52,3

14,3 14,1

[2022] 12021]

[1443]

[2022] [2021]

[2023] [2023i

[2024] [2024]

[2025] [2025]

Если изменить строение субстрата так, что конформация его D-формы будет отвечать требованиям продуктивного связывания, то можно получить субстраты с обращенной стереоспецифичностью. Так, многие субстраты с ограниченной конформационной подвижностью обладают значительно большей реакционной способностью в D-форме, чем в Ь-форме (табл.48) [2020,

страница 28
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Химия протеолиза" (8.49Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
хранение вещей недорого
Комод ARIVA-471
билеты на концерт asking alexandria в москве
стол со стеклянной столешницей

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(02.12.2016)