химический каталог




Химия протеолиза

Автор В.К.Антонов

фичности" (S,,), ха-рактеризующие предпочтительность (S,.^+1), нежелательность (S,,^-1) и ин-дифферентность (+1>S,.>-1) фермента к данной аминокислоте в данном положе-нии гидролизуемой последовательности.

Для субстратов пепсина индексы специфичности для положения Р наиболее и наименее предпочтительных остатков составляют: Leu +2,46, Phe +2,28, Тгр 1,67, Glu +1,49, Не -5,25, Arg -6,23.

Анализ индексов специфичности позволяет сделать ряд интересных выводов. Во-первых, в положении Р^ наблюдается корреляция индексов специфичности с гидрофобностью боковых цепей (см. разд.1.4), тогда как в положении Р и других такая корреляция отсутствует. Во-вторых, в положении Р, крайне нежелательны изолейцин, положительно заряженные аминокислотные остатки и Pro

4.3. Специфичность

175

(индекс специфичности для этого остатка -оо, т.е. он не встречается в этом положении ни в одном из исследованных пептидов). Значительный интерес представляют средние абсолютные значения индексов специфичности для каждого положения. Эта величина характеризует максимальное положительное и отрицательное отклонение от случайного распределения аминокислотных остатков в данном положении, т.е. "жесткость" требований фермента к структуре боковой цепи. Эта величина максимальна для положения р , значительно отклоняется от

единицы в положениях Р3, Pg

и р:

Р2 и близка к единице для остальных поло-

жений (рис.55). Это означает, что пепсин специфичен в основном к структуре остатка, образующего расщепляемую связь своей карбоксильной группой, а общая длина связывающего субстрат участка активного центра пепсина соответствует 6-7 аминокислотным остаткам. Аналогичная картина наблюдается и для химозина (1932).

Рис.56. Зависимость констант скорости второго порядка от суммарных индексов специфичности пепсина свиньи [1907]

Нумерация соответствует приведенной в табл.39

Рассчитанные таким способом индексы специфичности, по-видимому, отражают вклад каждого остатка аминокислоты в общую скорость расщепления данной связи пепсином. Это видно из того, что существует четкая корреляция между суммарными индексами специфичности для синтетических пептидов и константами скорости

*cat/*m^ ш гидролиза, катализируемо-

го этим ферментом (рис.56) [1907].

линейная зависимость кинетических констант и суммарных индексов специфичности описывается формулами:

lnfe

cat

13,75 ± 0,671п(?3

31,34 ± 1,75,

(44)

cat —

Ш-- = 16,13 ± 1,081п(?3,, + ?3.) - 36,77 ± 2,82.

1С I iJ J

(45)

176 Глава четвертая. Ферментативный гидролиз. Феноменология

Вместе с тем, корреляция между суммарными индексами специфичности и величинами отсутствует.

Корреляции, приведенные на рис.56, являются примером зависимости структура субстрата - скорость гидролиза, представленной в общем виде на рис.54.

Наклон графика ln&cat/iT от ln(J]S{J + ?Sj), очевидно, характеризует специфичность пепсина.

Несколько иной подход к статистическому анализу специфичности пепсина [1956] основан на расчете вероятности расщепления данной связи, которая выражается как отношение числа расщепляемых связей данного типа к общему числу таких связей в рассмотренных последовательностях. Например, в исследованных авторами 177 пептидах и белках (содержащих суммарно 6910 пептидных связей) остаток аланина встречается 502 раза и в 82 случаях этот остаток образует своей карбоксильной группой расщепляемую связь. Вероятность расщепления составляет 82/502=0,16.

Хотя статистические индексы специфичности лишены какого-либо определенного физического смысла и являются просто эмпирическими параметрами, корреляции типа (44) и (45) ценны в практическом отношении. Они позволяют с известной точностью расчитывать a priori константы ферментативного гидролиза любых последовательностей аминокислот. Так, на основании индексов специфичности был предложен субстрат пепсина - ProThrGluPhe-Phe(N02)Argbeu, один из наиболее быстро №са1/Кт и 5,2-10б М-1 о-1 ) гидролизуемых этим ферментом [18831 -

Рассмотренные статистические методы не всегда дают удовлетворительные результаты в отношении предсказания скорости гидролиза. Это может объясняться несколькими причинами. Во-первых, исходные данные по расщеплению пептидов и белков в ходе структурных исследований не являются количественными и наблюдаемые результаты могут сильно зависеть от условий эксперимента. Во-вторых, если первичная специфичность (например, по остатку Р1) вносит основной вклад в скорость гидролиза, то вариации удаленных аминокислотных остатков будут слабо проявляться в опытах по определению структуры, но могут заметно влиять на начальные скорости, полученные в кинетическом эксперименте. Наконец, в тех случаях, когда структура субстрата сказывается как на величине k ., так и на К', исходные данные в зависимости от соотношения

cat m

[S]q и могут отражать изменения или максимальной скорости или отношения &cat/JT. По-видимому, эти факторы ответственны за плохую корреляцию суммарных индексов специфичности и кинетических констант гидролиза синтетических пептидов (см. табл.40) в случае пептидных субстратов а-химотрипсина.

Еще один способ статистического анализа специфичности основан на использовании метода Фри и Вильсона (19571, в соответствии с которым любой переменный фактор, связанный со структурой, может быть представлен суммой аддитивных Екладов отдельных элементов структуры

K = fl.n + V <46>

при условии, что

EaJin=0, (47) где п - молекула субстрата в данной серии субстратов; i - положение остатка

4.3. Специфичность

177

в последовательности (Р , Р2 и т.д.); а -вклад остатка в измеряемый параметр fe; р, - суммарный вклад для всей серии субстратов. Если имеется подходящим образом подобранная серия субстратов, то, решая систему уравнений (46) и (47), можно получить значения вкладов каждой аминокислоты в каждом положении в измеряемую кинетическую константу. Этот вклад, в принципе, не зависит от того, в состав какого субстрата входит данный остаток, а только от типа аминокислоты и от ее положения в последовательности. Таким образом, на основе рассчитанных вкладов можно предсказать значения кинетических констант для любого пептида. Этот метод был использован для анализа специфичности субтилизина, трипсина, тромбина и некоторых других протеаз И 958-1961 ].

4.3.2.2. Корреляции типа линейных зависимостей свободных энергий

Рассмотренные выше корреляции имеют тот недостаток, что они не оперируют с какими-либо параметрами, характеризующими физико-химические свойства субстратов. Вместе с тем очевидно, что именно последние определяют способность субстрата к взаимодействию с ферментом.

Корреляции типа линейных соотношений свободных энергий для ферментативного гидролиза были получены для ограниченного числа субстратов некоторых протеаз. Наиболее подробно в этом отношении изучены сложные эфиры ацилами-нокислот - субстраты а-химотрипсина, трипсина и некоторых других ферментов [1962-1964).

Влияние структуры боковой цепи. Мз данных, приведенных е табл.43, можно видеть, что при увеличении размера боковой цепи константа скорости второго порядка (fe2/Ks) катализируемого химотрипсином гидролиза возрастает, хотя и имеются отдельные исключения (производные валина, изолейцина и отчасти

Таблица 43. Кинетические константы катализируемого а-химотрипсином гидролиза эфиров N-ацетиламинокислот (рН 7,8; 25°С; 0,1 М КС1) [1723]*

Номер Субстрат \ ,с"1 V с~1 К -103, М s fe_2, М 1с 1 К/К , М"1с"1 2 s

1 AcGlyOMe 0,109 0,298 702 0,15 0,155

2 AcAlaOMe 2,27 5,67 1270 7,6 0,018

3 AcButOMe 8,81 1 ,68 417 3,1 21 ,1

4 AcValOMe 0,98 0,21 500 0,15 1 ,96

5 AcNvlOMe 55,8 9,3 100 14,3 558

6 AcNleOMe 103 19,1 34,4 34,4 2990

7 AcIleOMe 1 ,0 0,18 100 0,09 10

8 AcPheOMe 796 111 7,63 207 1 ,04-Ю5

9 AcTyrOEt 5000 200 17,2 67 2,9-Ю5

10 AcTrpOMe* * 730 29 2,52 - 2,9-Ю5

*Константы обозначены в соответствии с кинетической схемой (30). **pH 7,0; 25°С; 3,17% CH3CN [1761] •

12. В.К. Антонов

178

Глава четвертая. Ферментативный гидролиз. Феноменология

Рис.57. Зависимость константы скорости 2-го порядка реакции химотрипсина с метиловыми эфирами N-ацетиламинокислот от гидрофобности боковой цепи

триптофана). очевидно, что скорость гидролиза в этой серии субстратов коррелирует с гидрофобными свойствами боковых цепей (рис.57), однако стери-ческие факторы играют определенную роль как в связывании, так и в катализе.

субстрата (рН 7,8; 25°С) [1965]

Наблюдается также линейная корреляция между гидрофобностью боковых цепей субстратов и константами скоростей ацилирования и деацилирования химотрипсина [1965„1966].

Стерические эффекты боковой цепи проявляются в константах скорости ацилирования [1967,1968] и деацилирования [1969] а-химотрипсина эфирами алифа-

1970-1974]. Наряду с индексом гидрофобности было предложено [1975] использовать значение молекулярной рефракции.

Если не учитывать стерические эффекты, то для Метиловых эфиров N-ацетиламинокислот можно написать корреляционное уравнение [17231:

Это уравнение показывает, что специфичность в этом ряду субстратов зависит исключительно от гидрофобности боковой цепи. Иное положение наблюдается для субстратов с короткой или разветвленной боковой цепью, например для нитрофениловых эфиров алифатических карбоновых кислот. В этом случае гидрофобность заместителя проявляется слабо и основной вклад в скорость ацилирования фермента вносят индукционные и стерические эффекты [1964,1972]:

lgfe2/Ks=(2,18+0,17)0* + (0,53±0,1)Es + (3,46+0,17). (49)

Следует отметить также, что для ферментативного катализа в отличие от неферментативного корреляционные уравнения требуют введения так называемого параметра специфичности, характеризующего соответствие субстрата и активно-

lgHj-2,Z96*-0,7ZEs

тических кислот, причем наклон графиков зависимостей &2/Ks и &3 от Es примерно равен единице. Аналогичные зависимости были получены в работах [1726,

lgfe2/Ks = (2,2+0,1 )7С - 0,9±0,05.

(48)

Рис.58. Зависимость констант скоростей деацилирования ацилхимотрипси-нов - производных алифатических карбоновых кислот - от констант гидрофобности Ганча для апо-лярных фрагментов ациль-ной группы; ьзято из:

1- [1976]; 2- [19691; 3- [1972]

4.3. Специфичность

179

го центра фермента [1976]. Для химотрипсинового гидролиза сложных эфиров таким параметром является величина %. Это можно продемонстрировать на примере зависимости константы скорости деацилирования n-нитрофениловых эфиров алифатических (и арилалифатических) кислот от индукционных, стерических и гидрофобных эффектов (рис.58). В координатах lg&3-2,29a*-0,72Es от % получается зависимость, проходящая через максимум, указывающий на ограниченность размеров активного центра. В целом, зависимость характеризуется тремя участками: а) участком, не зависящем от гидрофобности алкильной цепи, что характерно для субстратов с короткой или разветвленной ацильной группой; для этих субстратов скорость деацилирования определяется индукционными и стерическими эффектами; б) участком линейной зависимости с наклоном около единицы для неразветвленных субстратов с числом метиленовых звеньев, равным или большим трех, где скорость зависит от гидрофобности заместителя; 6) участком с отрицательным наклоном для субстратов с числом СН2-групп, большим шести, где проявляется ограниченность длины связывающего субстрат участка активного центра.

Необходимо отметить, что амиды N-ацетиламинокислот выпадают из указанных корреляций, однако данных по влиянию боковой цепи субстрата на гидролиз таких амидов очень мало.

Сложнее обстоит дело в случае трипсина. Константы скорости второго порядка (fe2/Km) для реакции трипсина с эфирами ациламинокислот, содержащими короткую боковую цепь (глицин, аланин, масляная кислота), близки соответствующим константам их гидролиза химотрипсином (табл.44). То же самое наблю дается и для констант скорости деацилирования различных ацилхимотрипсинов и ацилтрипсинов (197?) (ср. табл.43). Однако скорость гидролиза трипсином резко возрастает при введении в боковую цепь на достаточном удалении от С -атома положительного заряда.

Таким образом, на стадии ацилирования специфичность трипсина определяется как гидрофобными взаимодействиями боковой цепи субстрата с ферментом, так и наличием заряда, причем последнее увеличивает скорость ацилирования в

Таблица 44. Кинетические параметры гидролиза сложных эфиров ациламинокислот трипсином [1977-1979]

Субстрат \, с"1 V °"1 к .ю3, м a fe2/Ks, M"V1

AcGlyOEt 0,032 0,1 830 0,04

AcAlaOEt 0,25 - 36 6,9

AcButOMe 7,6 * 1 ,52 0,47 16

AcPheOMe 55 173 110 5И02

AcTrpOMe - 31 -

AcTyrOEt 36 193 47 7.6.102

TosOrnOMe 54 5,4 16 3.4-102

BzLysOMe 5.9-103 22,3 4,9 1 ,2.106

BzArgOMe 2-10* 23,3 2,2 4.6.106

*Для бензоилпроизводного.

180 Глава четвертая. Ферментативный гидролиз. Феноменология

102—103 раз. Что же касается стадии деацилирования (&3), то здесь зарядовое взаимодействие, по-видимому, не играет существенной роли: величины &3 для ацилхимотрипсинов и ацилтрипсинов весьма близки.

Следует отметить, что в отношении n-нитрофениловых эфиров карбоновых кислот трипсин менее чувствителен к гидрофобности ацильной группы. Соответствующее корреляционное уравнение для этой серии субстратов [1980]

кг

lg— = (0,34±0,06)7С - (4,4+0,1) (50) К

8

имеет коэффициент при тс вдвое меньший, чем этот же коэффициент для гидролиза таких субстратов а-химотрипсином (0,74) (1970]. Корреляционные уравнения рассмотренного типа были предложены для субстратов папаина [1981] и термолизина [1982].

Еще один пример корреляции структуры субстратов и их реакционноспособ-ности - это гидролиз пептидов карбоксипептидазой А. Для серий субстратов ZX-Phe и ZGly-X, где X - варьируемый аминокислотный остаток, была обнаружена [1738] линейная зависимость lgKm от гидрофобности боковой цепи остатка X (рис. 59,а). Однако каталитическая Константа (fe t) для этих веществ практически не зависит от гидрофобной боковой цепи (рис.59,6).

Рис.59. Зависимости констант связывания (а) и каталитических констант гид-

ролиза (б) субстратов ZGlyGlyX в реакции с Zn (1) и Со (2) карбоксипептидазой А от констант гидрофобности Ганча [1738]

Заместитель (X): Gly (I); Ala (IJ); Nva (III); Leu (IV); Ше (V); Phe (VI); Val (VII)

Зависимость величины *cat/xm от размеров боковой цепи n-нитрофенилкарбо-ксилатов была исследована также на примере эластазы [1983]. Она оказывается очень сходной с зависимостью, наблюдаемой в случае химотрипсина (см. рис. 58) с той разницей, что максимум ее приходится на эфир масляной кислоты.

Следует остановиться на резонансных эффектах ацильной группы в реакциях ферментативного гидролиза. Резонансный эффект заместителя в общем случае должен снижать реакционную способность производных карбоновых кислот, стабилизируя резонансную форму

4.3. Специфичность

181

R-CH-CH-C-XR1.

Немногочисленные данные по гидролизу химотрипсино

страница 27
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Химия протеолиза" (8.49Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
решотка для кровати ленточная
мебельные светильники
купить чугунные сковородки
fisler кастрюли

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(28.04.2017)