химический каталог




Химия протеолиза

Автор В.К.Антонов

6 0,0096

AcPhe-AlaNH2 2,8 15,0 0,186

AcProPhe-NH2 0,7 24 0,029

AcAlaProPhe-Nr^ 2,3 2,2 1,04

AcProAlaPhe-NrLj 0,44 18 0,024

AcAlaPhe—GlyNH2 0,355 23,2 0,015

AcProPhe-GlyNr^ 0,705 14,9 . 0,051

ZGlyProPhe-NHg 0,096 2,4 0,04

ZGlyProPhe-GlyNB^ 0,08 2,0 0,04

ZGlyProPhe-LeuNH2 0,225 1,5 0,15

ZGlyProPhe—LeuAla 0,35 0,5 0,7

ZGlyProPhe-GlyGly 0,26 1,3 0,2

ZGlyProPhe-GlyLeu 0,68 0,4 1,7

AcProAlaProPhe-NH2 2,8 3,4 0,82

AcProAlaProPhe-AlaMH2 18,7 1,6 11 ,7

AcProAlaProPhe-GlyNH2 11 ,0 4,6 2,39

AcProAlaProPhe-AlaAlaMHg 36,6 0,83 44

AcProAlaProPhe-AlaAlaAlaHHg 37 0,82 45

AcProAlaProPhe-PheMILj 8,0 0,21 38,1

"Место расщепления показано дефисом.

венное значение имеют взаимодействия P„-S„ и Fc-S,, тогда как взаимодейст-вия в "четных" подцентрах мало влияют на скорость гидролиза И 908]. На примере эластазы было показано [1844], что взаимодействия P3-S3 проявляются при ацилировании фермента субстратом. В случае зтого фермента первичная специфичность зависит от длины субстрата.

По-видимому, общим является то обстоятельство, что вторичная специфичность в данном локусе зависит от характера взаимодействий в другом (или других) локусах (см., например, табл.41).

Таблица 41. Отношение к /К в субстратах типа Z-X-A-ArgpNA

А Х1 *2 {к ./К )_. г (к /К cat ml, cat m >X x2

Тромбин Фактор Xa Фактор XIa Фактор XIIa С-белок

Gly Phe Gly 1,87 1,89 2,7 0,26 3,44

Phe Phe Gly 9,2 0,14 0,5 0,82 0,46

*По данным [1868].

170 Глава четвертая. Ферментативный гидролиз. Феноменология

Отмечена также зависимость скорости гидролиза от состояния ионизации удаленной от гидролизуемой связи группы. Так, замена в орадикинине С-конце-вой карбоксильной группы на карбоксамидную снижает скорость гидролиза Phe5--Ser6 связи в 2,5 раза, но не влияет на расщепление связи Pro7-Phe8 эндо-олигопептидазой В [1895]. Интересный пример роли конформационного состояния субстрата на его чувствительность к гидролизу дипептидил-карбоксипептидазой приведен в работе [1901]. Замена остатка глицина в положении Р! соединения: Н S R

V

СООН

R=H или СНч , FA = фуроилакрилоил на аланин делает субстрат нечувствительным к гидролизу. Анализ ЯМР-спектров этих веществ и модели фермента позволили предположить, что в продуктивной конформации комплекса Михаэлиса метильная группа аланинового остатка наталкивается на атом серы.

Наконец, следует отметить, что вторичная специфичность может сильно меняться в зависимости от вида организма. Так, ренин человека эффективно гид-ролизует ангиотензиноген и человека и собаки, тогда как ренин собаки не расщепляет ангиотензиноген человека [1800,1886]. Это проявляется и на уровне пептидных субстратов, моделирующих N-концевую последовательность ангио-тензиногенов.

4.3.1.5 Третичная и четвертичная специфичность. Ограниченный протеолиз

При анализе расщепления белков протеолитическими ферментами возникает новая проблема, связанная с пространственной структурой субстратов. Этой проблеме посвящены-многочисленные обзоры [1909-1913]. Известно, что нативные белки, как правило, значительно более устойчивы к протеолизу, чем денатурированные (см., например: [1909, гл.5]). Это привело Линдерстрем-Ланга еще в 1952 г. к теории, согласно которой протеолиз нативных белков идет через стадию их денатурации [1914], причем сама протеиназа может способствовать денатурации, т.е. выступать как денатураза. Процесс может идти в зависимости от отношения скоростей демаскирования пептидной связи (&d) и ее гидролиза (й^ по "последовательному" (й или "параллельному" (zipper) механизму

(й^й^). Тип механизма может зависеть от природы субстрата, протеиназы и условий реакции, в частности концентрации продуктов гидролиза (19151- Эти представления согласуются с множеством экспериментальных фактов и на их основе были разработаны методы измерения скорости разворачивания белков. Оказалось [19161, что скорости разворачивания лизоцима и РНКазы, измеренные по скорости протеолиза разными ферментами, совпадают между собой и со скоростью денатурации, измеренной независимым методом. В пользу таких представлений говорят также факты значительно большей чувствительности к протеолизу апоферментов, чем холоферментов [1917,19181.

4.3. Специфичность

171

Вместе с тем известны, и все более множатся, случаи протеолиза нативных белков, в основном, случаи так называемого ограниченного протеолиза [1909, 1919], или процессинга. Сюда относятся давно известные процессы активации зимогенов (см. гл.5), образования биологически активных пептидных гормонов, процессы экспорта белков из клетки и др.

Точки ограниченного протеолиза определяются, во-первых, первичной и вторичной специфичностью гидролизующего фермента. Так, например, энтеропепти-даза, имеющая трипсиноподобную специфичность, расщепляет связь, образованную карбоксильной группой лизина в последовательности AspAspAspAspLys трип-синогенов (1920,1921). Процессинг предшественников пептидных гормонов часто идет путем расщепления связи двух остатков основных аминокислот или связи, образованной одним из этих двух остатков с другой аминокислотой (1815, 1922]. Очень часто вблизи основного остатка имеется остаток пролина, создающий, по-видимому, особую конформацию расщепляемого участка [1816,1923]. Локальная конформация расщепляемого участка - это второй важный фактор ограниченного протеолиза. Было показано, что обычно расщеплению подвергаются связи, расположенные в подвижных петлях белковых молекул или участках, соединяющих компактные субглобулы - домены [1917]. Так, например, пепсин подвергается расщеплению внешними протеазами и автокаталитически в области участка цепи, соединяющего два домена с отщеплением 46-членного С-концевого полипептида [1924]. Часто сайты процессинга расположены в "омега-петлях" -участках из 6-16 остатков свернутых так, что рассто. ше между их N- и С-

о

концевыми остатками не превышает 10 А 119131-

Анализ большого числа структур предшественникбв пептидных гормонов показал, что место процессинга расположено в области с высокой вероятностью образования р-шпильки и по соседству с высокоупорядоченными вторичными структурами [19251. Наличие вторичной структуры важно для расщепления не только белков, но и относительно коротких пептидов [1926]. Наконец, еще два фактора, важных для протеолиза нативных белков, - это доступность гидролизуемой связи и подвижность расщепляемого участка [1927 1930]. Оба эти фактора могут быть смоделированы из данных рентгеноструктурного анализа или установлены экспериментально на основании значений температурного В-фактора в кристалле [1928], причем наблюдается хорошее совпадение предсказанных и экспериментально установленных мест протеолиза. Несомненно, что только реализация всех указанных условий приведет к эффективному расщеплению белка в нужном для функционирования месте.

Ограниченный протеолиз был подробно исследован в количественном аспекте на примере расщепления аео-казеина и других казеинов химозином и родственными протеиназами [1931-1937]. Было показано,что расщепление связи Phe-Met в пептиде:

HIs-Pro-HIs-Pro-HIs-Leu-Ser-Ptie-Met-Ala-Ile-Pro-Pro-Lys-Lys,

(98) (ЮО) (105) - (110) (112)

являющемся пептидом 98-112 аео-казеина, заметно превосходит скорость расщепления самого белка (fe =68,7 с-1; К =0,049 мМ [19331). Решающим является

cat т

переход от пептида 104-111 к пептиду 103-111, т.е. введение остатка Leu, что приводит к увеличению k /К в 330 раз. Последовательность 98-102 сни-

172 Глава четвертая. Ферментативный гидролиз. Феноменология

жает К более чем на порядок [19311- Эти данные говорят о преимущественной роли вторичной, а не третичной специфичности в катализе (см. также гл.6).

Довольно подробно исследована кинетика гидролиза фибриногена и пептидов, моделирующих участки протеолиза этого белка тромбином [1866,1867,1938J. Было установлено, что тромбин сначала отщепляет фибринопептид А от а-цепи, после чего происходит полимеризация дез-А-фибриногена и лишь затем отщепляется фибринопептид В (1938). Значение к ./К для отщепления фибринопептида

с , cat m

А достигает 11,6-10 М о . Некоторые данные о скорости ограниченного протеолиза белков приведены в табл.42.

Таблица 42. Кинетические параметры ограниченного протеолиза некоторых белков

Фермент Субстрат рН fe +, с"1 cat' К -103, м m cat m И"1с'1 Литературный источник

Химотрипсин Панкреатический трилсиновый ингибитор 7,5 1 ,4-10-8 2-10"6 7 [1939]

Трипсин быка То же 7,5 8,7-Ю-10 8,7-Ю-11 1 .10* [1939]

То же Соевый трилсиновый ингибитор 8 2,5-Ю-6 1 ,25-10~9 2.106 [1939]

и Трипсиноген быка 8,1 2,5-Ю-3 0,4 6,25 [1940]

н " свиньи 8,1 5,5-Ю-3 0,48 11,4 [1940J

Химотрипсино-ген А - 0,18 1 ,1 163 [1940]

¦I В - 1,6 0,57 2.8.103 [19401

Трипсин 1 • Ветшавter la imbrlcata Панкреатический трилсиновый ингибитор 8,2 0,0016 1 ,6-Ю-7 1 -106 [1939]

То же Соевый трилсиновый ингибитор 8 0,12 З-Ю-4 4-Ю5 [1939]

Калликреин ткани человека Выс окомолекуляр-ный кининоген 0,43 0,005 В,6.ЮЛ [1941 ]

То же Низкомолекулярный кининоген 1 ,83 0,0125 14,6.104 [1941 ]

Энтерокиназа быка Трипсиноген 5,6 1 ,48 7•10-3 2-105 [1920]

То же свиньи То же 5,6 4,8 7-Ю-2 6,8-Ю4 [1942]

Химозин м-Казеин 6,6 68,9 0,05 1 ,4-10б [1934]

6-Казеин 6,6 0,56 0,00 7 0,8-Ю5 [1934]

Ренин Ангиотензиноген *у6 50 1 -10-3 5-Ю7 [923]

Известно много примеров ограниченного протеолиза различных ферментов (см. в: (1909)), что, по-видимому, имеет регуляторное значение.

Следует кратко остановиться на процессинге сигнальных пептидов и вирусных полипротеинов. Сигнальная последовательность прокариотических и эука-риотических белков организована таким образом, что имеется кластер положи-

4.3. Специфичность

173

тельно заряженных остатков на N-конце, центральный гидрофобный кор (около 12 остатков) и полярный С-концевой фрагмент, характеризующийся упорядоченной вторичной структурой. Месту расщепления сигнальной протеиназой предшествует последовательность трех остатков А-Х-В, где А - Ala, Leu, Val, Не, а В - Ala, Gly, Ser (1854,19431. Сама сигнальная протеиназа (у Escherichia coll [1944]) содержит внутренний сигнальный пептид (остатки 70-76), важный для связывания с мембраной.

Многие РНК-содержащие вирусы образуют в ходе созревания полибелок, который затем процессирует под действием входящей в его последовательность вирусной протеазы (654,1945]. "Нарезание" вирусных белков обычно начинается с аутопроцессинга и происходит строго по сайтам, разделяющим белки с различной функциональностью. Эти сайты могут быть образованы различными парами аминокислотных остатков, например GlnGly, TyrGly и AsnSer у пикориавирусов, РпеРго, ТугРго и др. у ретроЕирусов и т.д. Чем в данном случае определяется специфичность расщепления остается неясным. Более того, у ретровирусов, как известно, аспартатная протеиназа, входящая в состав полибелка, функционирует в виде димера. Остается открытым вопрос об аутоактивации этого фермента.

Внутриклеточный нелизосомальный протеолиз происходит с участием АТР-уби-китин зависимой системы протеолиза [1910,1912]. В эту систему входит небольшой белок убикитин (9 кда) и несколько ферментов, катализирующих присоединение убикитина его С-концевым глицином к е-аминогруппе гидролизуемого белка, расщепление белка в образовавшемся конъюгате и регенерацию убикитина. Эта система гидролизует преимущественно аномальные клеточные белки [1946,1947]. Предполагается, что узнавание аномальных белков связано с состоянием их N-концевой аминогруппы. Ацетилирование этой группы препятствует гидролизу белка убикитинзависимой системой протеолиза (19481. кроме этой системы в клетке, по-видимому, функционирует АТР-зависимая, но' убикитинне-зависимая система протеолиза с участием высокомолекулярных протеиназ - про-теосом [19491.

ММеется много примеров влияния четвертичной структуры белка на его устойчивость к протеолизу. Так, дрожжевая гексокиназа устойчива в виде димера к протеолизу дрожжевыми протеазами, но при диссоциации димера образующиеся мономеры легко отщепляют фрагмент, важный для димеризации [1950]. Аналогичное явление наблюдается у фосфорилазы А при действии трипсина и глюкозы, когда тетрамерный белок диссоциирует на димеры (19511. Еще один пример проявления четвертичной специфичности протеаз - действие трипсина на тетрамер (а2рг) триптофансинтазы (19521. Оказалось, что р-субъединицы не подвергаются расщеплению в тетрамере, но если подвергнуть фермент диссоциации, то они расщепляются трипсином. а-Субъединицы ступенчато расщепляются ферментом так, что они теряют активность. В составе полного фермента реализуется лишь первая ступень гидролиза без потери активности триптофансинтазы. Таким образом,.четвертичная структура белка-субстрата может в значительной степени изменить ход гидролитического расщепления за счет маскирования определенных мест протеолиза или за счет конформационных изменений в этих положениях.

174 Глава четвертая. Ферментативный гидролиз. Феноменология

4.3.2. Количественные зависимости структуры субстратов и их реакционной способности

Рассмотренные выше данные не выходят за рамки качественных закономерностей, не позволяющих делать какие-либо предсказания в отношении реакционной способности субстратов в реакциях ферментативного гидролиза. Ниже мы рассмотрим возможности количественного анализа специфичности.

4.3.2.1. Статистический анализ специфичности

Один из методов количественного анализа специфичности протеолитических ферментов заключается в статистическом анализе частоты расщепления различных пептидных связей в пептидах и белках [1953-1956]. Соответствующие исходные данные можно найти в работах по структурному анализу последовательности аминокислот в белках (см., например: (1197])-

Метод заключается в подсчете частоты встречаемости каждой аминокислоты в каждом положении гидролизуемой последовательности и анализе достоверности наблюдаемых отклонений от случайного распределения. В качестве примера приведем расчет специфичности свиного пепсина [1955] по отношению к остатку Не в положении Р,.

N-

Общее число исследованных пептидов

Общее число остатков Не

Число остатков Не в положении Р.

500 372 3

(3/372)100

20

Е А, о

,/20

0,81 . 4,99,

Частота встречаемости Не в положении Р,: А, 1е

Средняя частота встречаемости Не в положении Р,: А,

где А, - частота встречаемости каждой из 20 аминокислот в положении Р, Отклонение от случайного распределения: К, 11е=0,81/4,99=0,16. Граница доверительного интервала &.%^=еа, где е=2 (для а=0,95) и o«Sn - среднеквадратичное отклонение от единицы; &.%^=-0,84. Индекс специфичности Jle =

-(l-AX,)/K1iIle = -5.25.

В результате расчета можно получить "индексы специ

страница 26
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Химия протеолиза" (8.49Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
крепеж для велосипеда на крышу
купить набор ножей золинген
футбольная экипировка магазины в москве
сколько стоит техобслуживание чиллеров

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(24.05.2017)