химический каталог




Химия протеолиза

Автор В.К.Антонов

даза [763,1795-17971. Другая цистеиновая протеиназа - катепсин Н функционирует преимущественно как аминопептидаза, однако гидроли-зует п-нитроанилид бензоилартинина [17981. Еще один пример - действие анги-отензин превращающего фермента на защищенные олигопептиды. Гидролиз рели-зинг фактора лютеинизирующего гормона"этим ферментом происходит, как это показано на схеме [17991

I 1 1

GluHlsTrp-SerTyr-GlyLeu-ArgProGlyNH2.

Отмечена способность, сериновых карбоксипептидаз проявлять эндопептидазную активность [18001. Карбоксипептидаза Y, кроме того, катализирует гидролиз изопептидных связей, образованных 6-карбокоильной группой аспарагиновой кислоты в некоторых белках [1801].

4.3.1.3. Первичная специфичность

Очень большое число работ посвящено влиянию остатков, соседних с расщепляемой связью, на скорость гидролиза субстратов. Собственно первичная специфичность определяется не только положением данного остатка в цепи полипептида, но и его вкладом в наблюдаемую скорость гидролиза. В некоторых случаях этот вклад имеет решающее значение. Так, трипсин и сходные с ним ферменты расщепляют связи, образованные карбоксильной группой основных аминокислот (Lys, Arg), и этот фактор является наиболее важным для катализа, тогда как в других случаях (например, у пепсина) характер остатков, примыкающих к расщепляемой связи, может иметь меньшее значение, чем характер, удаленных от нее остатков. Первичная специфичность папаина определяется остатком в положении Р2 (см. номенклатуру: (17451) полипептидной цепи [18021. Однако, чтобы не создавать путаницу в терминологии, здесь мы будем рассматривать первичную специфичность как специфичность к остаткам в положениях Р, и Р' пептида.

В структуре аминокислотого остатка можно различать три важные для специфичности группировки: боковая цепь (R), заместитель при атоме азота (X) и

164

Глава четвертая. Ферментативный гидролиз. Феноменология

заместитель при карбонильной группе (Y): X-NHCHC0-Y.

А

Структурные особенности группы R определяются ее свойствами: липофиль-ностью (гидрофобностью), объемом и зарядом. Группа X может быть атомом водорода или полипептидной цепью, а группа Y - полипептидной цепью, алкокси-или алкил(арил)аминогруппой или гидроксилом. Все эти особенности имеют решающее значение для специфичности.

Очень небольшое число протеаз обладает абсолютной специфичностью к какому-либо конкретному остатку аминокислоты. К таким ферментам относятся, например, Б-оксопролил-пептидаза (3.4.19.3), специфичная к N-концевому пиро-глутамильному остатку (704,1803), некоторые дипептидазн [1024,1028,1038], пролинспецифичные ферменты [222,1030]. Однако уже эти последние гидролизуют также связи, включающие остатки оксипролина, N-метилаланина, саркозина и аланина [1804,1805].

Большинство протеаз обладает "групповой" первичной специфичностью. Можно различать ферменты, гидролизующие амидные связи, образованные: а) основными остатками аминокислот (Lys, Arg, His), б) объемистыми гидрофобными остатками (Тгр, Туг, Phe, Leu), 6) алифатическими неполярными остатками (Gly, Ala, Ser, Gin, Asn), г) остатками, содержащими карбоксильную группу в боковой цепи (Asp, Glu), и д) остатками, содержащими третичный атом азота в основной цепи (Pro, Hyp и др.).

По-видимому, наиболее распространены протеазы первой группы - группы трипсина. В нее входят как амино-, так и карбоксипептидазы [682,1064,1806], важные пищеварительные ферменты - сам трипсин и энтеропептидаза [18071, ферменты системы коагуляции крови [313,1808-18131, системы комплемента (558,18141, многочисленные и еще мало исследованные ферменты процессинга [1815,18161. Среди последних ряд ферментов специфичен к парам основных остатков (расщепляемые связи, образованные такой парой, или связь между такой парой и следующим в направлении к С-концу остатком) [627,632,18171- У трипсина наблюдается заметная предпочтительность к расщеплению связи Lys-Arg по сравнению со связью Arg-Lys [18181.

Следует отметить, что некоторые ферменты, обладающие специфичностью к основным остаткам в положении Р.,, достаточно эффективно расщепляют связи, образованные другими остатками. Это особенно относится к цистеиновым проте-иназам папаину [1745,1802,1819,1820], калпаинам I и II (1821,18221 и др.

Вторая группа ферментов включает протеазы с химотрипсиновой специфичностью. Сюда также входят ферменты с разной позиционной специфичностью - ами-нопептидазы [985,1769,18231, карбоксипептидазы [250,252,18241 и эндопепти-дазы - химотрипсины из разных источников [1715,1825-18271, мышечные протеи-назы [1827-18291, пищеварительные ферменты - пепсин [1749,1750,1830-18331 и гастриксин (1832,18331, микробные протеиназы, например входящие в комплекс "проназа" (369,18341, и др. Эти ферменты, как правило, обладают довольно широкой специфичностью, гидролизуя связи, образованные не только ароматическими, но и различными алифатическими аминокислотными остатками. К этой же группе относятся АТР-зависимые протеиназы Escherichia coll - протеиназы La и Т1, а также, по-видимому, некоторые мышечные высокомолекулярные проте-

4.3. Специфичность

165

иназы, входящие в состав протеосом [1835-18371- Протеиназы ретровирусов расщепляют преимущественно связи, образованные карбоксильной группой фенил-аланинал тирозина, однако наблюдается также гидролиз связей, содержащих в Р1-положении остаток метионина [1838,18391.

Наиболее изученными представителями третьей группы ферментов, гидроли-зующих связи, образованные карбоксильной группой алифатических остатков с небольшой боковой цепью, являются эластазы [1840-18451 и ферменты, родственные субтилизинам [1765,1846,18471- Эти ферменты наименее специфичны и используются для максимально глубокого расщепления белков (протеиназа К). К этой же группе можно отнести коллагеназы позвоночных. Для этих ферментов характерно наличие в Р1-положении субстрата остатка глицина, а в IJ - остатков Leu, lie, Fhe, Val [18481. В то же время коллагеназы клостридий преимущественно гидролизуют связи с остатком Gly в -положении и объемистым гидрофобным остатком в Р [18491- Остаток глицина в Р -положении характерен также для субстратов дипептидилкарбоксипептидазы (энкефалиназы) [18501 и протеиназы IV из папайи [18511-

Относительно немногочисленна группа ферментов, расщепляющая связи, образованные карбоксилсодержащими аминокислотными остатками. Сюда относятся протеиназа Staphylococcus aureus [18521, родственная ей протеиназа Streptomyces thermovulgarls [18531, аминопептидаза А (9851 и некоторые другие протеазы. Интересно, что в зависимости от состава буферного раствора эти ферменты могут расщеплять связи с Glu и Asp в Р1 (например, в трис-буфере) или только с Glu (в ацетатном буфере) (18531. Коллагенолитические протеазы беспозвоночных гидролизуют связь Glu в Р .

Наконец, ферменты, расщепляющие связи с остатком пролина могут быть специфичны к Pro в P.J- и в Р'-положениях (соответственно пролил- и пролинпеп-тидазы).

Наименее выраженная первичная специфичность наблюдается у так называемых сигнальных пептидаз. Среди расщепляемых связей имеются связи, образованные остатками серина, аланина, глицина, изолейцина, глутамина. в Р -положении и изолейцина, аспарагина, валина, гистидина и др. в V-положении. По-видимому, для этих ферментов более важна вторичная структура сигнального пептида [18541.

В ряду однотипных ферментов роль аминокислотного остатка в положении Р субстрата для проявления специфичности протеазы может быть охарактеризована отношением констант скорости второго порядка при замене одной аминокислоты на другую. Такие данные для ряда сериновых протеиназ типа химотрипсина приведены в табл.37. Подобное отношение при замене Arg на Lys (в субстратах Tos-Gly-Pro-X-pNA) составляет для тромбина 460, для белка С системы свертывания крови - 48 [18111, а для фактора Ха - 49 [18121.

В случае амидаз разделение по уровням специфичности теряет смысл. Данные по модификации субстратов амидазы из Pseudomonas aeruginosa [17711 показывают, что, например., метилирование атома азота резко увеличивает как ft t> так и йт. Для ацетамида &cat=162 с-1 и Кт=0,83 мм, а для N-метилацетамида &cat= 1080 с-1, Кт=233 мм, что, по-видимому, обусловлено непродуктивным связыванием. Однако в случае пропиламида метилирование приводит как к увеличению К (с 7,8 до 248 мм), так и к падению й (с 374 до 0,3 с-1).

166

Глава четвертая. Ферментативный гидролиз. Феноменология

Таблица 37. Отношение констант скорости второго порядка №са1/й )

для ряда сериновых протеиназ при замене одной аминокислоты (А) на другую (В) в положении Р

Субстраты BocAlaAla-X-SBzl (по данным [1827])

X {к ./К ),/{k cat m'A cat m В

А В Химотрипсин Лейкоцитарная эластаза Панкреатическая эластаза Катепсин G Химаза I Химаза II

Leu Ala 1428 0,3 5,88 - - -

Leu Met 2,56 2,59 1 ,35 1,1 0,26 0,26

Met Ala 1057 1 ,17 2,32 - - -

Специфичность 6-лактамаз сильно зависит от типа 6-лактамных антибиотиков (1856,1857]. Так, 6-лактамаза дикого типа Escherichia coll гидролизует бен-зилпенициллин (VII), цефалотин (VIII) и цефалокситин (IX) с константами скорости второго порядка, различающимися более чем в 107 раз.

WH2comsx/„.3

3

СООН

к .=2000 с 1; К =0,02 ММ cat m

VII

0CCH„

к =120 с 1; К =0,2 ММ cat m

VIII

к .=0,004 с 1; К =0,65 ММ cat m

IX

Следует отметить, что для некоторых ферментов разделение по уровням специфичности лишено смысла из-за того, что они строго специфичны лишь к одному или очень небольшому числу субстратов. Так, почечный ренин гидролизует белок - ангиотензиноген, отщепляя концевой декапептид [923]:

AspArgValTyrlleHlsProPheHlsLeu,

а также гидролизует очень небольшое число синтетических аналогов N-концевой последовательности ангиотензиногена. Другие из исследованных соединений этим ферментом не расщепляются.

4.3. Специфичность

167

4.3.1.4. Вторичная специфичность

Для многих протеолитических ферментов структура аминокислотных остатков субстрата, удаленных от расщепляемой связи, имеет важное значение. Систематические количественные исследования вторичной специфичности были проведены для а-химотрипсина [1825,1858-1861], трипсина [1808,1862-1864], тромбина, плазмина, и других ферментов системы свертывания крови [1808,1862,1865-1868], сериновых мышечных протеаз [1828], тонина [1869], калликреина [1870], эластазы [1843,1871-1874], микробных сериновых протеаз [1846,1859, 1860,1875-18771, папаина [1819,1820], пепсина и других аспартатных протеаз

[1082,1830,1878-1887], КарбОКСИПеПТИДаЗ [1768,1806], терМОЛИЗИНа [1888,

18891, аминопептидаз [985,1890] и ряда других ферментов [448,1053,1891-1902].

В результате этих работ было выяснено, что представители разных групп протеолитических ферментов по разному "чувствительны" к вторичным взаимодействиям. Так, трипсин, папаин и некоторые другие ферменты относительно слабо чувствуют удаленные от расщепляемой связи остатки, тогда как пепсин, эластаза и др. изменяют скорость гидролиза на 4-5 порядков (табл.38) [1906].

Таблица 38. Влияние вторичных взаимодействий на катализ протеолитическими ферментами

Фермент Субстрат k ./K (II) cat m Литературный

источник

I II * JK (I) cat m Термолизин ZGly-LeuAla ZAlaGlyGly-LeuAla 0,09 [1888]

Карбоксипептидаза В AcGly-Arg Ac(Gly)4Gly-Arg 1 ,09 [1806]

Трипсин ZLysOMe Z(Ala)2LysOMe [1903]

Папаин ZValGlu-LeuGIy Z(Gly)2ValGlu-LeuGly 4,7 [1819]

Постпролинован эндопептидаза ZGlyPro-Leu ZGlyPro-LeuGlyGly 4,8 [448]

Аминопептидаза А LeuNH2 Leu-LeuLeu 16 [1890]

Тромбин BocLysOMe Boc(Gly)2LysOMe 32,5 [1865]

Химотрипсин AcTyr-GlyNH2 Ac(Ala)gTyr-GlyUHg 192 [1858]

Катепсин D ZPhe-PheOpp* Z(Ala)2Phe-Phe0pp >720 [1880]

Пепсин ZPhe-PheOpp Z(Ala)2Phe-Phe0pp 2000 [1880]

Субтилизин BPN' AcAlaOMe Ac(Ala)2AlaOMe 2275 [1904]

Эластаза AcAlaOMe Ac(Ala)2AlaOMe 3875 [1905]

*0рр - см табл.39

Вторичные взаимодействия могут по разному влиять на оба кинетических параметра й t и Кт. Так, для субстратов пепсина наблюдаются сравнительно небольшие колебания Кт при переходе от да- к тетра- и пентапептидам, а значения k изменяются более чем на пять порядков (табл.39).

168

Глава четвертая. Ферментативный гидролиз. Феноменология

Таблица 39, Кинетические константы катализируемого пепсином гидролиза пептидов [1878,1907-]

Номер Субстрат* k c~1 cat К , MM m ft ./К , М-1с-1 cat m

1 ZAla-Phe(N02)Apm 0,002 1,46 1,4

2 ZPhe(N02)-AlaApm 0,0068 1,30 5,3

3 ZPhe(N02)-ValApm 0,01 0,78 13

4 Zbeu-Phe(N02)Apm 0,011 0,73 14,5

5 ZPhe(N02)-PheArg0Me 0,034 0,92 37

6 ZPhe-Phe(N02)Apm 0,034 0,88 39

7 AcPhe-PheApm 0,102 2,37 43

8 ZPhe(N02)-PheApm 0,052 0,74 70

9 HGlyGlyPhe-PheApm 0,95 3,9 245

10 ZGlyProPhe-PheOpp 0,056 0,14 400

11 ZAsnPhe(N0?)-PheApm 0,45 0,84 540

12 ZValPhe (N0?)-AlaApm 0,55 0,96 580

13 ZValPhe(NO )-PheApm 0,31 0,17 1850

14 AcPhe(N02)-PheAlaAla0Me 5.2 0,85 6100

15 ZLeuValPhe(N02)-AlaApm 4,3 0,59 7300

16 ZAlaAlaPhe(N0?)-PheApm 43,8 1,51 29000

17 ZGlyHisPhe-PheOpp 15,$ 0,44 35900

18 ZGlyGlyPhe-PheOpp 71,8 о", 42 1 ,8.105

19 ZGlyllePhe-PheOpp 12,6 • 0,07 1 ,8.105

20 ZPheGlyPhe-PheOpp 24,6 0,11 2.25-105

21 ZGlyLeuPhe-PheOpp 134 0.03 4.46.105

22 ZALaGlyPhe-PheOpp 145 0,25 5.8.О5

23 ZPheGlyGlyPhe-PheOpp 127 0,13 9.76.105

24 ZGlyAlaPhe-PheOpp 409 0,11 3.7-Ю6

25 ZAlaAlaPhe-PheOpp 282 0,04 7.05-106

*Арт - NH(CH2)3n'/ \>; Opp - 0(CH_)_N C~j); место расщепления

4-' _/ показано дефисом. В то же время изменение длины пептидов - субстратов химотрипсина - приводит к изменениям как ftcat, так и Кт в пределах двух порядков (табл.40).

Не только длина пептида, но и характер остатков, удаленных от расщепляемой связи, играют важную роль в ферментативном их расщеплении. Сравнение пептидов 18, 24 и 25 в табл.39 показывает, что замена глицина на аланин в положении Р2 приводит к увеличению ftca1/Km более, чем на порядок. В то же время аналогичная замена в положении Р3 увеличивает эту константу только в два раза. В случае субстратов химотрипсина характер отщепляемого остатка аминокислоты резко.меняет субстратные свойства дипептидов - введение в Р^ аланина вместо глицина увеличивает ^oat/Km в 20 раз, замена же на валин почти не изменяет константу скорости; введение пролина приводит к потере субстратных свойств (й{ 75 мм) (18261.

Вторичная специфичность не обязятельно монотонно затухает с удалением от расщепляемой связи. У сериновых протеаз - трипсина и химотрипсина - сущест-

4.3. Специфичность

169

Таблица 40. Кинетические параметры гидролиза пептидов а-химотрипсином [1825,1841 ,1858]

Субстрат • к ., с-1 cat К , mM m к JK -10"3, cat m м-V1

AcPhe-NH2 0,22 21 0,01

AcPheGlyNH2 0,14 14,

страница 25
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Химия протеолиза" (8.49Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
недорогие курсы по созданию сайтов с нуля в москве
MM691
тумба слесарная металлическая для инструментов
стоимость светленз

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(09.12.2016)