химический каталог




Химия протеолиза

Автор В.К.Антонов

ти lg(Vnax-u) от !g[S]0 (рис.52,б) как наклон кривой в точке полунасыщения [т.е. в точке lg(V"max-u)=0]. Предложены также и другие методы определения коэффициента Хилла для тех случаев, когда Vmax неизвестно [1740, 1741]. В случае димерного фермента возможна ситуация, когда связывание субстрата одной субъединицей дестабилизирует комплекс другой субъединицы. При этом возникает так называемая полуцентровая реактивность [1742].

Отклонения от гиперболической зависимости скорости от концентрации субстрата могут возникать при олигомеризации фермента, что сопровождается изменением активности вследствие маскирования части активных центров. В простейшем случае, когда образуются линейные ассоциаты так, что стерически экранируются все активные центры за исключением расположенного на конце оли-

4.2. Связь скоростей и равновесий

157

Рис.53. Схема олигомеризации фермента с экранированием активных центров

гомерной цепи (рис.53), активность ассоциата будет связана с концентрацией фермента соотношением:

а =--,

1 + / /1 +

4Я1Е]

где а - удельная активность ассоциата; а, - удельная активность мономера;

К - константа ассоциации мономер — N-мер (предполагается равенство констант ассоциации на каждой стадии) [1743].

4.2. Связь скоростей и равновесий

Как и всякий катализатор, фермент не изменяет положения равновесия химической реакции. Однако для ферментативных реакций имеется одно обстоятельство, на которое следует обратить внимание. Ферментативный катализ, как правило, - многостадийный процесс, поэтому константа равновесия такого процесса -сложная величина, которую можно представить через константы равновесия отдельных стадий ("микроскопические" константы, К{):

к1 кг k{-1 Ki Е + S «—=• ES ^—»____«г-=. EQ Е + Р, (41 )

[Р] t К = - = ПК,.

eq [S] , t

Поскольку для любой стадии К{=й_{/й{, то выражение (41) можно написать в

виде: _{

Пй , -1

(42)

ПЙ, 1 {

Это соотношение известно как уравнение Холдена [1744], связывающее константы скоростей с термодинамической константой равновесия реакции. Уравнение (42) можно записать через изменение свободных энергий:

ago ="| AGf{ - Е ag*, (43)

где aG - изменение стандартной свободной энергии реакции; aG* - свободные энергии активации каждой стадии в обратной реакции; aG* - то же для прямой реакции.

Соотношение Холдена показывает, что реакции в прямом и обратном направлении протекают через одни и те же переходные состояния, т.е. что пути прямой и обратной реакции в точности противоположны. Этот принцип называется

158

Глава четвертая. Ферментативный гидролиз. Феноменология

принципом детального равновесия, или принципом микроскопической обратимости, и имеет важное значение для понимания механизмов реакций.

4.3. Специфичность

Ферментативный катализ характеризуется высокой чувствительностью к структуре субстрата и к условиям, в которых проводится каталитическая реакция. При анализе субстратной специфичности амидгидролаз необходимо различать несколько уровней:

N-

R

4

R2 R1 R1 R2' R° ft4

i-1 i_i

первичная специфичность

I-1 l_I

вторичная специфичность

I--1

третичная специфичность

Субстратная специфичность протеаз (как и других деполимераз) может проявляться на уровне остатка аминокислоты, образующей своей амино- или кар-боксигруппой расщепляемую связь (остатки Р1 и Pj в соответствии с принятой номенклатурой (17451) - так называемая первичная специфичность. Часто заметное влияние на способность субстратов гидролизоваться в присутствии протеаз оказывают остатки, удаленные от расщепляемой связи, т.е. вторичная специфичность.

В случае белков или больших олигопептидов общая пространственная организация молекулы может быть важным фактором, определяющим положение расщепляемой связи. Это так называемая третичная специфичность. Наконец, иногда проявляется зависимость катализа от олигомерной структуры гидролизуемого белка - четвертичная специфичность.

Далее в соответствии с классификацией протеаз можно выделить уровни позиционной специфичности - способности фермента катализировать гидролиз лишь N- или С-концевых аминокислотных остатков (экзопептидазы) или остатков, расположенных внутри полипептидной цепи (эндопептидазы).

Еще один уровень субстратной специфичности - это стереоспецифичностъ, т.е. чувствительность амидгидролаз к конфигурации асимметрических атомов в молекуле субстрата.

При количественном анализе субстратной специфичности ферментов возникает проблема выбора наилучшего критерия для такого анализа. Поскольку ферментативные реакции многостадийны, необходимо выбирать в качестве меры специфичности параметр, характеризующий определенную стадию или совокупность стадий процесса. Так, для трехстадийной схемы

1'

3'

4.3. Специфичность

159

можно говорить о специфичности на стадии комплексообразования (К =ft /ft ), ацилирования фермента (ft2) или его деацилирования (ft3). Однако при этом возникают определенные трудности, связанные с тем, что экспериментально определяемые константы 'равновесия или скорости могут быть эффективными величинами, включающими, например, константу диссоциации непродуктивного комплекса. Поэтому во многих случаях предпочитают пользоваться для характеристики специфичности константой скорости второго порядка №са1/Ят). которая не зависит от степени непродуктивного связывания субстрата. Эта величина .также может включать несколько кинетических параметров, если процесс идет через образование нескольких промежуточных комплексов.

Таким образом, анализ специфичности необходимо проводить, используя максимально возможную информацию о скоростях реакции на каждой стадии процесса.

Еще большие трудности возникают при сравнении специфичности разных ферментов. В этом случае относительная скорость гидролиза субстрата, катализируемого двумя ферментами, зависит от выбора субстрата. Для одного субстрата эти скорости могут быть одинаковыми, а для другого, даже сходного по строению, - совершенно разными.

В этой связи мне представляется наилучшим определение специфичности как способности фермента изменять свою шшамлпическую активность при изменении структуры субстрата. В соответствии с этим определением, если мы располагаем какой-либо количественной характеристикой структуры субстрата (Zg), специфичность фермента можно было бы характеризовать графиком типа представленного на рис.54. При этом мерой специфичности является наклон графика, построенного для большого числа субстратов, различающихся структурным параметром Zg (или суммарным параметром такого типа). Конечно, и в этом случае выбор субстратов имеет важное значение. Если, например, для анализа специфичности экзопептидазы взять серию защищенных дипептидов, то по отношению к этим субстратам экзопептидаза, по-видимому, не проявляет какой-либо специфичности.

Возможности такого подхода будут продемонстрированы ниже. Рассмотрим

экспериментальные результаты анализа специфичности амидгидролаз.

к

Рис.54. Зависимости константы скорости ферментативной реакции (ft) от структурного параметра субстрата (Zg)

1- отсутствие специфичности; 2- абсолютная специфичность; 3- промежуточный случай

4.3.1. Общая характеристика

Число работ по специфичности амидгидролаз огромно и не поддается сколько-нибудь исчерпывающему анализу. Многие ранние данные можно найти в обзорах: [178-180,1746-1746]. Появляются также обзоры, посвященные отдельным ферментам или группам ферментов: [181-183,185-187,1749-1752]. Ниже будут приведены данные, характеризующие специфичность амидгидролаз на различных уровнях ее проявления.

160

Глава четвертая. Ферментативный гидролиз. Феноменология

Таблица 35. Расщепление В-цепи инсулина некоторыми протеазами: 5 10 15

Phe-Val-Asn-Gln-HiB-Leu-Cys-Gly-Ser-HiB-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-

20 25 30

-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr—Pro-Lys-Ala

Фермент Основные разрывы между остатками Дополнительное расщепление между остатками Литературный источник

Химотрипсин А быка 16-17; 25-26; 26-27 15-16 [287, 1753]

Химотрипсин С быка 4-5; 6-7; 11-12; 15-16; 17-18; 24-25; 25-26 16-17; 26-27 [287]

Трипсин быка 22-23 29-30 [1754]

Эластаза свиньи 2-3; 6-7; 9-ю; 14-15; 15-16; 18-19; 23-24:26-27 [1755]

Протеаза I АсНгстоЪаоtег 29-30 - [587]

Коллагеназа Entomophllua coronata 11-12; 15-16 [474]

Папаин 3-4; 13-14; 17-18; 19-20; 25-26; 26-27; 6-7; 7-8; 8-9; 14-15 [1756]

Катепсин L 26-27 3-4; 13-14; 17-18 [1757]

Катепсин В 5-6; 8-9; 13-14; 14-15; 20-21 1-2; 3-4; 15-16; 17-18 [1757]

Пепсин свиньи 16-17; 24-25 10-11; 12-13; 14-15 [1758]

Катепсин D селезенки быка 1-2; 11-12; 24-25 13-14; 14-15; 23-24; 25-26 [1759]

Катепсин D эритроцитов 15-16; 24-25 - [1760]

Обычно уже на первых этапах поиска и выделения амидгидролазы, ее удается отнести к группе протеаз или к группе амидаз. С этим связан тип субстрата, используемого для тестирования активности фермента в ходе выделения и очистки. Если речь идет о протеазе, то дальнейшей ее характеристикой является определение позиционной специфичности, т.е. отнесение ее к группе экзо- или эндопептидаз. В большинстве случаев здесь не возникает принципиальных трудностей, поскольку активность экзоферментов обычно на несколько порядков ниже к субстратам эндопептидаз, чем к субстратам, содержащим незащищенные N-или С-концевые аминокислотные остатки. Однако необходимо отметить, что было выделено несколько протеаз, обладающих как экзо-, так и эндопептидазной активностью (см. ниже).

Следующим этапом качественной характеристики специфичности фермента является определение типа аминокислот, образующих расщепляемую связь (первичная специфичность). В случае эндопептидаз в качестве тестобъекта чаще всего используется В-цепь инсулина (табл.35). Такие исследования позволяют отнести фермент к одной из подгрупп, проявляющих специфичность к боковым цепям положитильно заряженных аминокислотных остатков (типа трипсина), нейтральных аминокислот с объемистой гидрофобной боковой цепью (тип химотрипсина)

4.3. Специфичность

161

Таблица 36. Сравнение эстеразной и амидазной активности некоторых амидгидролаз

ftcaf -1 с К -103 m M cat m irV1 b ./К (эфир) cat m Литературный источник

Фермент Субстрат Ь ./К (амид) cat m а-Химо-трипсин AcPheOMe AcPheNH2 57,5 0,039 1,5 37,0 0.38-105 1,05 3.6.104 [1761 ]

Трипсин BzLysOMe BzLysNH2 12,9 0,32 0,028 4,25 4.6-.105 75,3 0,61 .104 [1762]

Эластаза AcAla AlaOMe AcAlagPro-AlaNHg 120 6,1 0,067 2,1 17,9.10s 2,9-10J 617 [1763, 1764]

Субтилизин AcAla OMe AcAla^pNA 2300 0,023 1,6 0,03 1,44-Ю6 766 1 ,9-103 [1765]

Папаин BzArgOEt BzArgpNA 16,1 0,74 13 2,86 1,24-103 258,7 4,8 [1766]

Карбоксипептидаза Y AcPheOEt AcPheNH2 120 5/3 1,2 10 1 .105 530 189 [250]

Пепсин ZHisPhe(NO )-PlaOMe ZHisPhe(N0g)-PheOMe 0,13 0,07 0,4 0,52 325 135 2,4 Г17671

Карбоксипептидаза А BzGly-Gly-PlaOH BzGly-Gly-PheOH 500 20 0,33 1,0 1,5-106 2.104 75 [1768]

Лейцинами-нопеп-тидаза (хрусталик глаза быка) LeuOEt LeuNH2 »25 . 2.104 500 28 w50 ,, 7.10=' «7-10-5 [954]

Дипепти-дилкарб-оксипеп-тидаза Амидаза Peeudo-топаз aeruginosa. BzPhe-Pla-Ala BzPhe-Phe-Ala CH COOEt CHgCONHg 18,3 90 <1 162 0,065 0,065 660 0,83 2,8.10s 13.8.103 <1,5 4 1,9-Юэ 0,2 -5 <1 .10 [1769] [1770, 1771 ]

Пеницил-линамид-аза С H,,CH_ COOEt СЖСКСОШСН., COOEt 170 47 0,045 0,08 3,7-10^ 0,6-Ю6 6,3 [1772]

или с малой боковой цепью (тип эластазы), способных гидролизовать амидные связи рядом с остатком пролина (пролидазы) и т.д.

Более подробные сведения о специфичности получают из данных кинетических исследований гидролиза большого числа синтетических и природных субстратов.

4.3.1.1. Типы расщепляемых связей

Амидгидролазы практически всех типов способны катализировать гидролиз не только обычных пептидных связей, но и связей других типов - сложноэфирных, тиоэфирных, анилидных и др. Наиболее подробно изучен гидролиз сложных эфиров различными протеазами и амдцгидролазами. Соотношение между эстеразной и

11. В.К. Антонов

162

Глава четвертая. Ферментативный гидролиз. Феноменология

амидазной активностями сильно варьирует у разных ферментов (табл.36) - у некоторых сериновых протеаз оно достигает четырех порядков. У цистеиновых и аспартатных протеаз эстеразная активность лишь в несколько раз выше, чем амидазная, тогда как у амино- и карбоксипептидаз амидазная активность может превышать эстеразную. Многие амидгидролазы вообще не обладают эстеразной активностью (см., например: 1585,1773]). Эстеразная и амидазная активности могут быть обусловлены разным типом связывания и, возможно, разными каталитическими группами фермента. Такое положение, по-видимому, существует у сериновых карбоксипептидаз (карбоксипептидаз W и Y), оба типа активности у которых контролируются группами с разными значевжями рКа [1774].

Химотрипсин и трипсин расщепляют также лактонные связи в дикетоморфоли-нах - производных специфических амино- и оксикислот [1775-17771:

О

В. R =СбН5СН2: NH2 (СН2) д и др.,

Скорость гидролиза таких соединений почти не уступает скорости гидролиза обычных эфиров этими ферментами.

Следует отметить, что ни дикетопиперазины [1778], ни циклопептиды с числом аминокислот, меньшим 6 [1779-1781] не расщепляются химотрипсином или трипсином. Описаны еще два типа сложноэфирных субстратов химотрипсина. Это а-замещенные ациламинокислоты (I) [1782] и производные ацилкарбазатов (II) [1783,17841:

CJL-X-CH-COOC-H,. C,HcCH.N-COOCAH,NO_-n.

NHCOCA NHCOR

б 5

X=0,S,NH R=CH3> СН(СН3)ШСОСН3 или пептид

I II

Карбоксипептидаза А эффективно расщепляет карбаматные и карбонатные связи в производных фенилаланина:

О О

(^ОУо-счшснсоон и ^оуо-с-о-снсоон.

III IV

Соотношение констант скорости второго порядка (IV):(III)=82 [17851.

Многие протеазы расщепляют тиоэфирные (V) и тионовые связи (VI) И 786-17881:

О S

R-C-SR1 R-C-OR1.

V VI

4.3. Специфичность

163

Однако тионопептиды являются ингибиторами лейцинаминопептидазы [1789].

n-Нитрофенилтиоацетат гидролизуется химотрипсином практически с той же скоростью, что и п-нитрофенилацетат [1787], однако для гидролиза этиловых эфиров наблюдается более высокая реакционная способность тиоэфиров по сравнению с кислородными эфирами [1790-1793].

Из других типов связей, расщепляемых сериновыми протеазами, следует упомянуть гидразиды, гидроксаматы [17941 и широко используемые для тестирования многих протеаз п-нитроанилиды.

4.3.1.2. Позиционная специфичность-

Позиционная специфичность амидгидролаз ясна из номера их классификации и не нуждается в специальном рассмотрении за исключением тех случаев, когда фермент проявляет двойственную специфичность или когда новые данные заставляют пересмотреть принятую классификацию. Так, оказалось, что катепсин В проявляет не только эндопептидазную активность, но и функционирует как дипепти-дижарбоксипепти

страница 24
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Химия протеолиза" (8.49Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
Зеркала Compass купить
курсы кп прграмма 1с цена
сменная фильтруящая кассета фпв 80 50
выставка 3d-картин третий сезон нижний новгород билеты

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(09.12.2016)