химический каталог




Химия протеолиза

Автор В.К.Антонов

Фактор коагу- Ф 5-50 [1693,

ляции 1695,

Тромбин 1711 ]

Калликреин

Урокиназа <1

и др.

7-(GltPheMH-)4MCL Химотрипсин Ф 10 [1708]

AntLys-p-HA* Трипсин Ф 25 [1709]

Dns-D-Ala-Gly-PheN-Gly* Энкефалиназа Ф - [1704]

ZLysSBzl Калликреин S «4 [1697]

Плазмин и др.

и др.

4.1. Ферментативная кинетика

149

Таблица 33 (окончание)

Субстрат

Фермент

Метод

Чувствительность, нг

Литературный источник

HPhe-PheTOH

Лейцинаминопеп-тидаза

10-300

[1707]

Сокращения: тв - твердофазный метод; Hie^ - П-нитрофенилаланин;

ОМС - 7-окси-4-метилкумарил; АМС - 7-амино-4-метил-кумарил; MCL - 7-амино-4-метилхинолонил; АА - 2-аминоакридонил; Ant - антроноил-(0-амино-бензоил); p-NA - П-нитроанилид; SBzl - тиобензиловый ефир; Phe^ - 3-тиафенилфенилаланин;

Ф - флуоресцентный; Р - измерение радиоактивности; X - хроматографический; Фр - ферментативный; Сп - спектрофотометрический; S - определение SH-группы.

*Основан на внутримолекулярном тушении флуоресценции в субстрате.

4.1.3. Смысл и значение кинетических констант

Из экспериментов по стационарной кинетике реакции гидролиза субстратов и значений молярной концентрации активных центров фермента можно получить кинетические константы ft . и К', а также их отношение.

cat ш

Лишь в простейшем случае кинетической схемы (2) смысл величин ftcat и является однозначным - ftcat равна й2, т.е. константе скорости первого порядка превращения фермент-субстратного комплекса в продукты реакции, a равна Кв - константе диссоциации фермент-субстратного комплекса, причем последнее справедливо лишь при условии ft_.,»ft2

Значительно сложнее обстоит дело, если на пути от субстрата к продуктам образуется несколько фермент-субстратных комплексов. Так, для схемы (5) значения кинетических параметров будут:

^З^Р fe2fe3

ft = - = -. (2°)

cat 1+Кр ft2+ft_2+ft3

Кт (ft_1+ft3)(ft_2+ft3)

(21)

m ^+кF ft,(ft2+ft_2+ft3)

ftcat ^З^Р ft1fe2ft3

(22)

Таким образом, ни одна из экспериментально определяемых констант в общем случае не отражает ни прочности фермент-субстратных комплексов, ни скорости их превращений.

В зависимости от соотношения величин констант скоростей индивидуальных стадий экспериментально определяемые кинетические параметры могут принимать значения, приведенные в табл.34 (при условии ft_ »ftg).

Для схемы (7) имеем:

150

Глава четвертая. Ферментативный гидролиз. Феноменология

cat

Vfe3

ft_1+ft2 k3

*г+*з

ft_1+ft2

Таблица 34. Значения наблюдаемых кинетических параметров при различном соотношении констант скоростей индивидуальных стадий для кинетической схемы (5) [1715]

Вариант *Р *3 cat К' m ft ./Й" cat m

1 «1 «к_г К s

2 «1 »к 2 fe-2 к s

3 »1 «KZ ft3

4 »1 »ft_2 ft3 Wfe2

Если наиболее медленной стадией является образование комплекса ЕА, т.е. к >>к и к »к , то к =ft и К'=к ,/к,=К , если же лимитирующей стадией яв-ляется распад ЕА, т.е. >>ft„, но ft «ft„, то ft <.=k„, а Й'=К ft„/ft„. Незави-

— 12 3 2 cat о m s 3 2

симо от лимитирующей стадии отношение Ъ /Rj=t^/KB.

Приведенные соображения показывают, что наблюдаемые на опыте константы могут в зависимости от лимитирующей скорость всего процесса стадии отражать различные типы фермент-субстратного взаимодействия. По мнению 'Клиланда [17161, очень часто скорость ферментативного процесса лимитируется или скоростью изомеризации промежуточных комплексов, или скоростью диссоциации продуктов.

4.1.4. Непродуктивное связывание

Субстрат может связываться с ферментом таким образом, что образовавшийся комплекс окажется неактивным, т.е. неспособным превращаться в продукты реакции. Такой комплекс называют [1717,1718] непродуктивным, и его образование наряду с продуктивным комплексом приводит к изменению наблюдаемых кинетических параметров гидролиза. Действительно, для кинетической схемы

Е + S ^—- ES -> Е + Р (23)

К'

з

ES'

уравнение скорости образования продукта будет: ft_EE] [S]

2 о о V = -.

К + (1+й /Й*)[Б]

s за о

Отсюда следует, что величины экспериментально определяемых кинетических констант будут:

ft2 ks

Kl = - —. (25), (26!)

(24)

' cat

1+й /К'

s в

1+й /К'

4.1. Ферментативная кинетика

Таким образом, обе константы будут уменьшаться на одинаковую величину, и это изменение будет проявляться тем сильнее, чем больше соотношение констант К /К'. Очевидно, что величина k /К' не изменяется при непродуктивном связывании и остается равной й2/Ке- Характерным признаком непродуктивного связывания в серии однотипных субстратов является симбатное изменение й и iT при постоянном их отношении. В качестве примера можно привести данные по кинетике гидролиза сложных эфиров и амидов а-химотрипсина (рис.48). В отличие от амидов в ряду эфиров наблюдается непродуктивное связывание [17191 -

К,-10, Мо/риры) 2 3 1 5 В

Рис.48. Зависимость &2 от в ряду

амидных (I) и эфирных (JJ) субстратов а-химотрипсина [1719]

»- 4-PyTyrNH2; 2-

ClCH2C0TyrNH2; CH3TyrNH2; 6

3-РуТугШ. 4-

ClnnTyrOEt;

2'

CP3C0TyrNH2;

7- AcLeuTyrOMe; 8- BzTyrOMe

(Py - пиридиноил, Cinn - циннамоил)

10 г M (амиды)

В кинетической схеме с несколькими промежуточными фермент-субстратными комплексами (см. схему 5, разд.4.1.1) может реализоваться несколько иной тип непродуктивного связывания, а именно изомеризация первого комплекса в непродуктивный (ES'):

К

Е + S

ES

E*S

Е + Р.

(27)

К*

ES'

В этом случае наблюдаемые кинетические параметры будут [17151

3*Р

к

cat

К' т

Яр+(1+^)

где йр

К'

[ES']/[ESl.

Как и в первом случае, непродуктивное связывание здесь не влияет на отношение кинетических констант. Наконец, для обратимых реакций

Е + S

Е + Р

в условиях, когда йг«й_1, значение Кт в направлении образования субстрата равно К р=*_1/*_2' т'е- вообще никакого отношения к связыванию продукта не имеет (так называемая кинетическая константа Ван-Слайка) [1720].

152

Глава четвертая. Ферментативный гидролиз. Феноменология

4.1.5. Определение индивидуальных кинетических констант

Как показывают изложенные выше данные, анализ кинетики ферментативного гидролиза на основе величин &cat и может дать лишь ограниченную информацию о скоростях отдельных стадий и устойчивости промежуточных комплексов. Поэтому большое значение приобретает определение постадийных констант скорости и равновесия. С этой целью применяются как методы стационарной кинетики, так и методы исследования процесса на предстационарной стадии.

4.1.5.1. Стационарные методы

Здесь мы остановимся на трех методах, применяемых при исследовании гидролитических реакций.

Первый из них заключается в том, что подбирают два (или больше) субстрата так, чтобы стадии, лимитирующие скорость, для них были различны, но константы скорости одной иэ стадий одинаковы. Например, если взять в качестве субстратов а-химотрипсина л.-нитрофениловый эфир и амид N-ацетил-Х-фенилала-нина, то в первом случае лимитирующей стадией будет распад промежуточного ацилфермента, а во втором - его образование [1721]:

Е + S —* ES -> ЕА (+Р, ) -- Е + Р?. (28)

I. AcPheOC6H4N02, ft2»ft3 ; II. AcPheNH2, fe2c*3 "

Поскольку оба субстрата имеют одинаковую ацильную группу и отличаются только характером отщепляемого продукта Р , то значения k3 для них должны быть одинаковыми. Поэтому, чтобы определить й3 для субстрата II, достаточно получить &cat=&3 для субстрата I. Для всех соединений - производных ацетил- Ь-фенилаланина величину k2 можно найти из соотношения:

3 cat

^3 ^cat

Аналогично можно найти к =К'(r. +k )/k . Этот метод, однако, имеет огра-

S ГП с_ о о

ничейное применение, так как могут возникнуть осложнения из-за непродуктивного связывания и, кроме того, при близких значениях &3 и &cat он дает очень большую ошибку.

Второй метод заключается в использовании эффектора, влияющего только на одну стадию процесса. Пусть, например, имеется вещество, введение которого в систему влияет только на величину й2 (см. схему 28). В присутствии этого вещества кинетика гидролиза описывается уравнением:

- [Е] [S]

k3

(29)

3 K+k3

+ [S]

Решая совместно уравнения (8) (в предположении, что &2«й ,) и (29), мож-

4.1. Ферментативная кинетика

153

¦10 м - с

Рис.49. Определение индивидуальных кинетических констант с помощью введенного нуклеофила [1723] Гидролиз этилового эфира N-ацетил-

Ь-фенилаланина (25°С; 0,1 н. КС1; [E]q=1,03-10_s М) в отсутствии и присутствии 0,11 Ми 0,22 М 1,4-бутанди-ола

но показать, что в координатах 1/t> ¦* ¦* 1/[S]q две прямые (соответствующиие v и v*) будут пересекаться в точке с координатами 1/[S]o=-1/Ae и 1/v= =1/ft3tE]o (рис.49). Отсюда, зная Кд и k3, легко найти &2 [1722-1724].

В качестве эффекторов а-химотрип-сина были предложенн борная кислота, ионы меди, спирты и др. [1722,1723, 1725,1726].

Наконец, третий метод (метод Бойера [1727]) заключается в исследовании скорости включения в субстрат меченных изотопами продуктов реакции в условиях термодинамического равновесия системы.

Для схемы

2,0

над

**^*Т I_I_ 1.0

о

1,0щ<«'

Е + S

1

ES

ЕА

+

Р.

Е + Р,

(30)

равновесие может быть достигнуто введением продуктов Р1 и Р2 в концентраци-. ях, удовлетворяющих условию

[Р1][Pg]/[S].

Если Р1 и Р2 содержат радиоактивную метку, то эта метка будет включаться в субстрат (S). Измеряя скорость появления метки в субстрате в зависимости от различных равновесных концентраций Р1 и S или Р2 и S, получают кривые типа показанной на рис.50. Скорости включения Р1 и Р2 (соответственно R' и R) даются уравнениями [1727,17281

[Е]

R =

V*-2lP1]

(31 )

fc2*3

-)(1 +

[S]

[P,]

0,25 0,5 0,75 ID C,M

Рис.50. Зависимость скорости включения Н-ацетил-Ь-фенилаланина (г) и гли-цинамида (2) в N-ацетил-Ь-фенилаланилглицинамид от концентрации глицинамида

(рН 8,2; время инкубации 30 мин; [Б] =1б-10~4 М) [1729]

154

Глава четвертая. Ферментативный гидролиз. Феноменология

[Е]о

й' =---, (32)

11 й1 кг

(— + —)(1 + — + -)

кг [S] [Р,]

где К^=Кд и Кг=кг/к_г. В пределе при [S]»K., и [Р,]»^ и при условии, что к получим Я'=йЛЕ] . Зная можно найти L и J , а из зависимости

— 1 с. t О с. об

й* S-2

— = 1 + -(Р.] (33)

й к3 1

найти й_2- Наконец, к_3 можно вычислить из соотношения Холдена (см. разд. 4.2):

К

*2*з

Этим методом были получены все индивидуальные константы гидролиза N-аце-тилфенилаланилглицинамида химотрипсином [1729-1731], а также исследован гидролиз некоторых пептидов пепсином [1732].

4.1.5.2. Методы предстационарной кинетики

Эти методы описаны в многочисленных руководствах [1733-1736], и здесь мы рассмотрим лишь один пример. Пусть необходимо определить индивидуальные константы гидролиза п-нитрофенилового эфира ациламинокислоты, катализируемого химотрипсином. Реакция идет по схеме (7). Для этого необходимо измерить скорость образования нитрофенола на предстационарной стадии, что можно сделать с помощью аппарата остановленного потока, в котором реагенты смешиваются и изменение оптической плотности регистрируется в течение нескольких миллисекунд. Если эти опыты провести в условиях [E]q>[S]o при разных начальных концентрациях фермента, то можно получить зависимость изменения концентрации продукта от времени для разных значений [E]q. Эти величины связаны выражением:

йг[Е]о

[Р, ] = [S] И - ехр(---t)] (34)

1 ° К +[Е]

S о

Таким образом, эффективная константа скорости процесса

VE]o 1 h 1 1

к' = - или — =--+ —. (35), (36)

К +Ш к' К Ш к0

во 2 о 2

Строя зависимость Wk' [вычисленное из уравнения (34)] от 1/Шо, получим прямую с наклоном Кд/&2 и отсечением на оси ординат 1/&2.

Наряду с методом остановленного потока широко используются релаксационные методы - температурного и рН-скачка, ультразвуковой релаксации и др.

4.1. Ферментативная кинетика

155

4.1.6^ Отклонения от кинетики Михаэлиса-Ментен

Отклонения от кинетики Михаэлиса-Ментен в реакциях, катализируемых амидгид-рола?ами, возникают обычно в следующих случаях: 1) когда субстрат выступает одновременно в роли эффектора (ингибитора или активатора); 2) когда имеет место кооперативное связывание субстрата субъединицами фермента; 3) когда молекулы фермента взаимодействуют друг с другом, изменяя при взаимодействии сродство к субстрату И 7371.

Случаи ингибирования и активации субстратом описываются кинетической схемой:

Е + S ^» ES -- Е + Р (37)

К'

В*5

ES„

ES + P.

Соответствующее выражение для скорости образования продукта Р будет (16591:

P*S»[S]o

К'

-)(Е1 (S1

V =

(38)

(SI'

К + (SI + в о

Рис.51. Активация и ингибирование субстратом График в координатах Лайнуивера-Берка для гидролиза N-карбобензоксиаланилфенилаланина, катализируемого карбоксипептидазой А (25°С; рН 7,5; [Е]о=5,4-Ю-9 М) [1738]

Рис.52. Кинетические зависимости для аллосте-ричэских ферментов в прямых (а), двойных обратных (б) и логарифмических (б) координатах [1737]

З.Ог

2,0

1.0

О 1 2 3 4

t/fsj-яг-'м-'

6 lg[v/(Vm-v)J ff

0,025 0,05 [SJ„,m

1 2

i/[sJ0.m->

156

Глава четвертая. Ферментативный гидролиз. Феноменология

Типичный график зависимости 1/и от 1/[S]q для случая ингибирования и активации субстратом представлен на рис.51 [1738].

При больших концентрациях субстрата (левая ветвь графика) уравнение (38) можно преобразовать к виду (так как i?e«[S]Q):

BtS] г о

1 +-

к

R' = - = k„ - (39)

[Е] 2 [S] о о

1 +-

ИЛИ

1 1 Пв 1

+--. (40)

1-feVft 1-р 1-р [S]c

Зависимость 1/(1-*'/*2) от 1/[S]q будет иметь вид прямой, из наклона которой и пересечений с осями можно найти значения р и Г.

Хотя среди амидгидролаз очень немного ферментов, проявляющих кооператив-ность при связывании субстрата, все же такие случаи имеются, и поэтому необходимо описать простейшие способы их анализа (см. обзор:[1737]). Кооперативное связывание предполагает наличие в молекуле фермента нескольких центров связывания субстрата, причем связывание в одном из них или увеличивает сродство другого центра к субстрату (положительная кооперативность), или снижает его (отрицательная кооперативность). Ферменты, проявляющие такие свойства, называются аллостерическими. Зависимость скорости реакции от концентрации субстрата в случае положительной кооперативности представляет собой сигмоиду (рис.52,а,б). Анализ кинетики аллостерических ферментов проводят по уравнению Хилла [1739]:

lg---- = n(lg[S] - lg[S] ),

V - V •

max

где [S]Q - концентрация субстрата, при которой u=vmax/2; п - коэффициент Хилла, показывающий степень кооперативности связывания. При п=1 кооперативность отсутствует, при п>1 наблюдается положительная кооперативность, а при 7К1 - отрицательная.

Уравнение Хилла выполняется в относительно узком интервале концентраций субстрата и коэффициент п можно определить в этом интервале из графика зависимос

страница 23
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Химия протеолиза" (8.49Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
блок 51
купить недорого планшет
optoma проектор
трезвый водитель москва

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(22.08.2017)