химический каталог




Химия протеолиза

Автор В.К.Антонов

фективность и специфичность. Хотя в моделировании биокатализа достигнуты заметные успехи, все же в полной мере воспроизвести эти особенности ферментов на моделях до сих пор не удалось. В этой главе будет приведен основной фактический материал, касающийся эффективности и специфичности амидгидролаз.

4.1. Ферментативная кинетика

Как и всякий катализатор, фермент может проявлять свое действие в концентрациях, существенно более низких, чем концентрация субстрата. В этих условиях можно различить три фазы реакции: 1) предстационарную, когда концентрация свободного фермента резко падает (обычно до нуля при [S]o»[E]Q); 2) стационарную, когда скорость реакции почти не меняется во времени; 3) постстационарную, когда скорость реакции убывает во времени из-за значительного снижения концентрации субстрата (см. обзоры: [1613,1655-1661].

4.1.1. Стационарная кинетика

Обычно скорость ферментативной реакции измеряют на стационарной стадии. При этом концентрация субстрата и всех промежуточных продуктов изменяется пренебрежимо мало по сравнению с начальной концентрацией. Условие стационарности выполняется при степени превращения субстрата, не превышающем 10-15% (рис.43).

Если увеличить начальную концентрацию субстрата, то в отличие от неферментативных реакций скорость процесса в конечном счете достигает постоянной величины и далее уже не зависит от концентрации субстрата. При этом достигается насыщение фермента субстратом и скорость реакции становится максимальной. Явление насыщения указывает на то, что фермент и субстрат образуют комплекс, и этот последний претерпевает химическое превращение:

Е + S *-* ES -> Е + Р. (1 )

*-1

Образование фермент-субстратного комплекса является обратимым процессом, причем реагенты удерживаются в нем силами нековалентной природы. Существует множество физико-химических и прямых рентгеноструктурных данных, подтверждаю-

Рис.43. Зависимость концентрации продукта ферментативной реакции от времени 1 - предстационарная стадия; г - стационарная стадия; 3 - постстационарная стадия

142

Глава четвертая. Ферментативный гидролиз. Феноменология

щих образование таких комплексов (см. гл.6).

Выражение для скорости превращения субстрата, соответствующее схеме (1), хорошо известно как уравнение Михаэлиса-Ментен [1662]:

dP VE]o[S]o

— = V = -, (2)

at К +[S]

m о

где Я =й /й называют константой Михаэлиса. При выводе этого уравнения предполагается, что распад комплекса ES в направлении исходного субстрата происходит во много раз быстрее, чем его химическая трансформация, т.е. fe_1»*2. Если не вводить это допущение, то, как показали Бриггс и Холден [1663], значение R^(k +k )/к^. В более сложных случаях выражение для Кт становится еще более сложным. Поэтому предложено [1664,1665] обозначать константу диссоциации фермент-субстратного комплекса как субстратную константу йа=й_1/й1, а во всех остальных случаях величину, входящую в знаменатель уравнения (2), называть константой михаэлиса и обозначать как Ят или iT, где знак "прим" указывает на экспериментальное (кажущееся) значение. Величина константы скорости химического превращения также может быть сложной величиной. Обычно ее называют каталитической константой (ft .), она

cat

имеет размерность константы скорости первого порядка. Для схемы (1) ftcat=ft2 и характеризует число молекул субстрата, превращающегося в продукт в единицу времени (число оборотов).

Легко видеть, что когда в уравнении (2) Km»[S]Q, оно принимает вид

v = ft ДЕ] [S] /Я . (3)

cat о от

Величина ?оа1/Кт является константой скорости второго порядка для реакции фермента с субстратом.

Если выполняется соотношение Ят«[Б]о, то скорость реакции становится равной максимальной скорости:

v = V = ft ДЕ] , (4)

max cat о

а при условии Km=(S]Q u=0»5Vmax, т.е. константа Михаэлиса соответствует такой концентрации субстрата, при которой скорость реакции равна половине максимальной скорости.

Мы рассмотрели здесь простейшую схему односубстратной реакции, подчиняющейся кинетике Михаэлиса-Ментен. Более общими являются случаи, когда на пути от субстрата к продукту существует несколько промежуточных комплексов. Например, если имеются последовательно образующиеся два комплекса (за счет изомеризации ES в E*S)

ft1 ft2 ft3 E + S - ES ^—^ E*S -> E + P, (5)

то выражение для скорости будет иметь вид

WE]o[S]o

V = -, (6)

Я +(1+iLHS] m Т? о

4.1. Ферментативная кинетика

143

где iL, = - и К =

Если фермент-субстратный комплекс претерпевает последовательные химические превращения [1666]

ft, ftg ^3"

Е + S «=-* ЕЗ -> ЕА-» Е + Р_, (7)

й-1

P1

[E] ES]

о о

to V =--. (8)

К - + [S]

Реакции, катализируемые амидгидролазами, являются фактически односубст-ратными, поскольку изменением концентрации воды можно всегда пренебречь. Однако иногда возникает необходимость анализировать двухсубстратные превращения, катализируемые ферментами этого класса. В-частности, это относится к обратным реакциям синтеза пептидной связи и к реакциям транспептидации (см. разд.4.8). Два субстрата могут присоединяться к ферменту независимо (неупорядоченный механизм)

гЕАч. «Кь

Е ЕАВ Kz >ПРОДУКТЫ (9)

К^ЕВ^Ка

или последовательно (упорядоченный механизм)

КА *В \

Е =е-- ЕА «——* ЕАВ -> продукты. (10)

В зависимости от последовательности присоединения субстратов А и В и последовательности отщепления продуктов различают несколько типов упорядоченных механизмов ("пинг-понг", механизм Теорелла-Чанса и др.; см.: [1660]).

При условии быстрого установления равновесия, т.е. когда химические стадии идут медленнее, чем образование комплексов, общее выражение для скорости неупорядоченной двухсубстратной реакции дается уравнением

VE1o

V =--. (11)

^А ^В "*А*В 1 +--+ - + -

[А] [В] [А] [В]

о о о о

Для упорядоченного механизма (10) выражение для скорости будет

144

Глава четвертая. Ферментативный гидролиз. Феноменология

ft2[E)o

1 +

(12)

ЕВ) ЕА1 ЕВ]

о о о

Примером двухсубстратной реакции, катализируемой протеолитическими ферментами, является реакция траншептидации

Е + Р2 гидролиз К

fei \

3 йЛВ] К

4 5

Е + S ^-" ES-> ЕА «-—» ЕАВ -> Е + А-В, (13)

+ к,

р транспептидация

ft-1 + k-4

где В - акцептор транспептидации.

Если имеется возможность определить концентрацию продукта транспептида-ции в начальный период реакции, то выражение для скорости его образования (i>t) будет [16671

ЙЛЕ] [S] [В] 5 о о о

Vf = -, (14)

JL, —(К +ES] ) + [В] —(К +ES] ) + [В] ES] к2 й2

-4 5

где Е^, = -, а для скорости гидролиза (и )

fe4

WS]o[E]o

у = -. (15)

Я_ —(Я +ES] +ЕВ] ) + [В] —(К +ES] ) + [В] [S] Т ь m о о о ъ m о' о о

к2 д2

Для вывода уравнений ферментативной кинетики используется метод детерминантов Кинга-Альтмана [1668], а также различные формализованные методы, основанные на теории графов [1669-16711.

4.1.2. Методы определения кинетических параметров

Чтобы получить численные значения кинетических параметров, входящих в уравнения, приведенные в разд. 4.1.1, необходимо определить начальные скорости превращения субстрата в зависимости от его концентрации. Анализ этих зависимостей чаще всего проводится графически путем преобразования уравнений скорости в линейную форму. Так, по методу Лайнуивера-Берка [1672] линейным преобразованием уравнения (2) будет

11 Rm 1

- = - +---. (16)

v к ДЕ] k ЛЕ] ES]

cat о cat о о

Строя зависимости 1/и от 1/[S]Q, получают графики типа, представленного

4.1. Ферментативная кинетика

145

Рис.44. Определение кинетических параметров ферментативных реакций по методу Лайнуивера-Берка (а) [1672] и Иди-Хофсти (б) [1673]

Рис.45. Определение кинетических параметров двухсубстратных ферментативных реакций а - первичные и 6,6 - вторичные графики

на рис.44,а. Точки пересечения прямой с осями координат дают значения k .ЕЕ] и К .

cat о m

Другой способ линеаризации уравнений типа (2) предложен Иди и Хофсти [16731 (рис.44,б):

V

V = Ь ДЕ) - К -. (17)

cat о m[S)

о

Оценка точности определяемых значений кинетических параметров в этих и других типах линейных представлений уравнения Михаэлиса-Ментен дана в И 674-16771.

Анализ двухсубстратных реакций проводится обычно путем измерения скорос-

10. В.К. Антонов

146

Глава четвертая. Ферментативный гидролиз. Феноменология

ти в зависимости от концентрации одного из субстратов при фиксированных концентрациях второго субстрата. Вид графиков в двойных обратных величинах (рис.45) позволяет во многих случаях отличить упорядоченный механизм от неупорядоченного, а из вторичных зависимостей величин отсекаемых отрезков от концентрации второго субстрата - получить значения кинетических констант двухсубстратной реакции.

Практические методы измерения начальных скоростей реакций и анализа кинетических уравнений приведены во многих руководствах [1613,1659].

В результате такого анализа получают значение кажущейся константы Михаэ-лиса, смысл которой зависит от типа кинетического механизма (см. разд. 4.1.3), и максимальную скорость vmax=*cat[B]o.

Уравнение (2) можно представить в интегральной форме:

[Р] Кт [S]o

— = V--In —-,

t шах t [S3 -[Р]

о

где [Р] - концентрация продукта в момент времени t. Анализ этого уравнения

[S]o

проводят [1678], строя зависимости [Pl/t от 1/t-ln-. Получающаяся

[S] -[Р]

о

прямая имеет тангенс угла наклона, равный Кт, и отсекает на оси ординат отрезок, равный Vmax- Предложены интегральные уравнения и для более сложных случаев (см., например: [1679]), а также ряд способов анализа полной кинетической кривой ферментативной реакции [1680,1681].

Определение ошивности амидгидролаз. Титрование ожш&них центров. Чтобы из значений максимальной скорости получить величину &cat, необходимо знать концентрацию активных центров фермента. Это последнее значение определить не всегда просто, и оно известно лишь для ограниченного числа амидгидролаз.

Для определения абсолютной концентрации активных центров ферментов предложено несколько методов [1402]. Одна группа методов основана на применении необратимых (или квазинеобратимых) ингибиторов, селективно реагирующих с активными центрами исследуемого фермента. Если ингибитор содержит хромоген-ную или радиоактивную метку, то, отделив модифицированный белок и определив содержание метки, можно рассчитать концентрацию активных центров при условии, что известна молекулярная масса белка. Недостатком этого метода является- необходимость иметь строго селективный ингибитор, реагирующий с белком количественно. Убедиться в этом можно, только получив предварительно белок в чистом виде и исследовав реакцию модификации. Такие необратимые ингибиторы описаны в гл.5. Предложено также использовать некоторые прочно связывающиеся обратимые ингибиторы, например п-аминобензамидин для титрования трипсина И ТрОМбИНа [1682].

Если указанные выше условия выполняются и известно число активных центров в молекуле фермента, то определить абсолютную концентрацию фермента можно, не прибегая к меченым ингибиторам и выделению модифицированного белка. Используя концентрации ингибитора заведомо меньшие, чем концентрация фермента, и определяя остаточную активность фермента, можно найти искомое значение его концентрации (рис.46).

Другой способ титрования активных центров, применяемый в тех случаях, когда реакция идет ступенчато с накоплением промежуточного соединения, зак-

4.1. Ферментативная кинетика

147

Рис.46. Титрование активного центра фермента

Зависимость активности {А) от молярного соотношения ингибитора и фермента

лючается в измерении первоначального "выброса" гфодукта на предстационарной стадии [1208,1683]. Представим себе, что реакция фермента с субстратом приводит к быстрому образованию первого продукта (Р1) и медленному распаду промежуточного комплекса (ES') с образованием второго продукта (Pg>):

Е + S

ES' + Р.

Е + Р,

'Кривая накопления продукта во времени

как показано на рис.47. Экстраполируя прямую стадии процесса к нулевому времени, можно получить связанную с константами скоростей соотношением:

о1 о

(18)

будет при этом выглядеть так, соответствующую стационарной величину "выброса" {%),

если Ь^»Ьг, то ж = [Е]с

2.

(19)

[Pj]-10S,M

Удачными субстратами для титрования активных центров сериновых протеиназ являются тракс-циннамоилимидазол, п-нитрофенилацетат [1208], нитрофениловые эфиры N-защищенных аминокислот [1684], а также аминокислотные производные родамина [1685,1686]. Последние позволяют титровать фемтомольные концентрации ферментов. Предложен интересный титрант сериновых протеаз на основе бычьего панкреатического трипсинового ингибитора (БПТМ), в котором остаток лизина активного центра заменен на нитроанилиды различных аминокислот. Отщепление нитроанилина приводит к регенерации ингибиторных свойств БПТМ и реакция с ферментом имеет стехиометри-ческий характер [16871.

Наиболее общим методом определения абсолютной концентрации фермента является измерение скорости гидролиза субстратов в условиях [E]o»[S]o [1659, с. 114].

В сответствии с уравнением

Рис.47. Кинетика образования п-нитрофе-нола в реакции гидролиза п-нитрофенил-ацетата, катализируемой а-химотрипсином для двух концентраций фермента (а и б)

148

Глава четвертая. Ферментативный гидролиз. Феноменология

- =---, (19а)

о о

где Л=1 /(V^nj/v-]), график в координатах 1/(1 +Л,) от ЕБ]о/Л, "имеет наклон, равный 1/[E]q.

В тех случаях, когда определить абсолютную концентрацию активных центров по каким-либо причинам не удается, ограничиваются измерением активности фермента, выражая ее как количество фермента, необходимое для превращения 1 мкмоля субстрата в 1 мин. Предложено большое число субстратов и способов, в том числе автоматических [1688], позволяющих определить очень низкие концентрации амидгидролаз [1689-1714]. Некоторые из используемых для этой цели субстратов перечислены в табл.33.

Таблица 33. Некоторые субстраты, используемые для чувствительного определения активности амидгидролаз

Субстрат Фермент Метод Чувствительность , нг Литературный источник

Сукцинилальбумин + Пепсин Ф 1 [1694]

флуоре скамин

1г51-гемоглобин (тв) Трипсин Р 0,2 [1700]

14С-еластин (тв) Эластаза Р 1 [1700]

КМ-лизоцим (цитохром С) Трипсин X 2,5-10 [1706]

Химотрипсин

Казеин-(3-глюкозидаза (тв) Трипсин Фр 0,3 [1701 ]

Химотрипсин 0,3 [1701 ]

Плазмин 30 [1701 ]

Бромелаин 30 [1701 ]

Овомукоид + трипсиноген Энтеропептидаза X 2 [1714]

ЪеиШг+лейциндегидро- Лейцинаминопеп- Фр - [1702]

геназа тидаза

3H-BzPhe-Ala-ArgOH Карбоксипепти- Р 0,01 [1713]

даза Н

Карбоксипепти- Р [1689]

даза В Gln-His-Phe -Phe-Ala- Пепсин Сп 100 [17031

-LeuNH„ w Катепсин

с. Катепсин D

ZPheOMC Химотрипсин Ф 2 [1705]

Н-пептидил-АМС

страница 22
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Химия протеолиза" (8.49Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
лимузины на свадьбу недорого москва
реле блокировки
x magnit
рекуператор канальный пластинчатый pr 60-35 характеристики

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(19.02.2017)