химический каталог




Химия протеолиза

Автор В.К.Антонов

.

Фактический материал по каталитическим свойствам амидгидролаз (кинетика, специфичность, рН-зависимость и т.п.) собран в двух последующих главах. Эти данные вместе с результатами кристаллографических исследований являются основой для понимания собственно каталитического акта. Здесь целесообразно сначала проанализировать структуру фермент-субстратных комплексов и лишь затем - собственно акт химического расщепления связи. Первый этап такого анализа в настоящее время основывается на сравнительно немногочисленных данных рентгеноструктурного исследования комплексов ферментов с ингибиторами или очень медленно расщепляемыми субстратами (квазисубстратами). Экстраполяция этих данных на истинные фермент-субстратные комплексы требует известной осторожности, однако без этого любые выводы в механизме реакции будут не более чем гипотезами.

Имеющиеся сегодня данные показывают, что элементарный акт химического изменения амидной группы на ферменте происходит, по крайней мере, с наиболее адекватными субстратами, практически спонтанно, с очень низкими актива-ционными барьерами. Это приводит к мысли о том, что все события, приводящие к эффективному катализу амидгидролазами, разыгрываются на стадиях предшествующих образованию переходного состояния. Читатель заметит, что в этой книге автор сравнительно редко анализирует "структуру" переходных состояний. Я убежден, что особенно в ферментативном катализе такой анализ дает значи-

Введение

9

тельно меньше сведений, чем анализ структуры основного состояния реагирующей системы, который может базироваться на четких экспериментальных фактах. Это убеждение привело автора и его коллег к формулированию концепции ферментативного катализа, изложенной в последних разделах этой книги.

Итак, цель этой книги - попытаться по возможности с единых позиций рассмотреть химические аспекты ферментативного гидролиза амидной связи, выявить то общее и то особенное, что позволяет выделить амидгидролазы в самостоятельную и очень важную группу ферментов, и, наконец, еще раз попытаться ответить на вопрос о причинах уникальной эффективности и специфичности ферментов.

Глава первая СУБСТРАТЫ

1.1. Общая характеристика

Вещества, химическое превращение которых ускоряется под действием ферментов, называются субстратами этих ферментов. В этой книге будут рассмотрены процессы ферментативного гидролиза амидных связей в составе самых разных субстратов.

Подавляющее большинство субстратов протеаз представляет собой белки или пептиды. Здесь амидная, или, как еще ее называют, пептидная, связь образует структуру, связывающую отдельные остатки аминокислот:

...NHCH(R1)CONHCH(Rg)С0...

Гидролизуемая амидная связь может находиться в середине цепи, и в этом случае ее расщепление катализируется эндопептидазами, или же на N- или С-конце полипептидной цепи, и в этом случае она-является объектом действия экзопептидаз. Свойства самой амидной группы мало зависят от ее положения в полипептидной цепи. Известно большое число ферментов катализирующих гидролиз иных, чем пептидные, амидных связей. Некоторые типы таких связей приведены ниже:

амиды кислот

карбоновых (R=Alk или Аг)

формил (R=H) и ацил (R=Alk) аминокислоты

аспарагин (п=1) глутамин (п=2)

R

пенициллины

N-ацетилглюкозамины

никотинамид и его производные

креатин

2,5-диоксопиперазин

'См. табл. 12 (НФ 3.5.1 и 3.5.2)

1.2 Анидная группа

11

Таким образом, расщепляемая амидная группа может входить в самые разные, как линейные, так и циклические, структуры, встречающиеся среди природных соединений. Кроме этого, многие протеолитические ферменты катализируют гидролиз амидных и других связей в производных карбоновых кислот, не являющихся их природными субстратами. Например, такие протеазы, как а-химотрипсин, папаин и др., эффективно катализируют гидролиз амидов, анилидов и эфиров N-ациламинокислот.

Если говорить о пептиднобелковых субстратах протеолитических ферментов, то их структурные особенности целесообразно проанализировать в несколько этапов, рассмотрев сначала собственно расщепляемую амидную (пептидную) группу, затем аминокислотный остаток изолированно и в составе короткого олигопептида и, наконец, белковую молекулу в целом.

1.2. Амидная группа

Амидную группу можно формально рассматривать как объединяющую в единой структуре альдегидную (кетонную) и аминную группировки. Однако такое представление неверно, так как свойства амидной группы далеко не являются аддитивной комбинацией свойств, входящих в нее группировок (см.: обзоры [11-133). Это обусловлено главным образом взаимодействием неподеленной пары электронов азота с тс-электронами двойной углерод-кислородной связи. Вследствие этого амидную группу можно рассматривать как структуру, возникающую при суперпозиции двух резонансных форм: нейтральной (I) и цвитерионной (II), причем доли этих форм составляют соответственно 0,6 и 0,4 [141.

V-N( а .,>=< а

С1' ЧН С1' ЧН

I II

Такое представление хорошо объясняет многие свойства амидной группы, однако не является в настоящее время полным.

1.2.1. Геометрия

Представление о взаимодействии неподеленной пары электронов N-атома с тс-электронами двойной связи С=0 в амидах приводит к ряду следствий: а) длина связи C-N в амидах должна быть меньше, чем в аминах, а длина связи С=0 -больше, чем в кетонах; б) атомы О, С, N и Н амидной группы должны лежать в одной плоскости; в) амидная группа может существовать в цис~ и транс-кон-формациях, разделенных значительным активационным барьером:

Посмотрим, как выполняются эти следствия в реальных молекулах. Однако прежде необходимо сказать несколько слов о номенклатуре, используемой при описании геометрии амидной группы.

Структура амидной группы может быть описана пятью длинами связей:

12 Глава первая. Субстраты

из которых наиболее важными для ее характеристики являются длины связей С-0 и C-N) и шестью валентными углами: СаС'0, CaC'N, OC'N, C'NCa, C^NH и C*NH. По рекомендации Международной комиссии по номенклатуре [15] валентные углы обозначаются буквой % с соответствующими индексами, т.е. ас и т.д.

а

В плоской амидной группе первые три угла связаны отношением

гс СО + ^С С'N + ^OCN = 360°-а а

То же справедливо и для вторых трех углов. Кроме того, используются значения двугранных (торсионных) углов:

Ш1 = UClC'NC2' Ш3 = UOC'NCg" Ш2 = ШОС'ЫН« Ш4 = Ч^СШГ

Для цис-амидов и^и^О0 и ш3=шЛ=180°, а для транс-амидов u1=u2=180° и ш3=шЛ=0°. Торсионные углы в амидной группе связаны между собой отношением (ы1+ш2)-(ш3+ыЛ)=0. В большинстве работ пользуются лишь одним углом ы1, обозначая его как ш. В некоторых работах используют двугранные углы, обозначаемые как 6С, и еыИ6] или как %с и %ы M7L значение которых ясно из схемы: ч

J—Ж

___с1_схУ~ V2

Эти углы характеризуют отклонения амидной группы от плоского строения и связаны с углами и следующими зависимостями:

ес, (%с) = ш1 - ш3 + тс = -ш2 + шЛ + тс, № = ш2 - ш3 + тс = -ы1 + шд + тс.

Наконец, угол между биссектрисами 8С, и 8Ы иногда [17] обозначают как г, причем

= г ¦ 0,5(вс,-еы), шг = г - 0,5(ес,-вы) и т.д.

Межатомные расстояния в амидах могут быть получены или из данных кристаллографического, в том числе и нейтроне/графического анализа [12,18,19], или методом микроволновой спектроскопии [20,21]. В последнем случае можно получить геометрические параметры молекулы в изолированном (газовом) состоянии. —

Данные табл.1 показывают, что, как и следовало ожидать на основании резонансной модели амидной группы, C-N-связь в амидах значительно короче, чем в аминах. Однако для индивидуальных молекул амидов (в газовой фазе) длина связи С=0 не отличается от таковой в ацетоне. Уже ети факты показывают недостаточность представлений о суперпозиции резонансных структур (I) и (II) для описания амидной группы.

В конденсированном состоянии длина связи С=0 увеличивается. Результат]

1.2 Амидная группа

13

Таблица 1. Межатомные расстояния и углы в амидах, метиламине и ацетоне

Вещество и его состояние о rC-N,A гс=о-А Угол NC0, град. Угол NC'H(C), град. Угол ОС'Н(С), град. Литературный источник

HOCNHg

Газ 1,376 1,19 123,8 113,24 122,96 [20]

м 1.352 1,219 124,7 112,7 122,6 [21]

Кристалл 1 ,300 1 ,255 121,5 - - [22]

CH3C0NH2

Газ 1 ,36 1 ,21 125 - 122 [23]

Кристалл 1 ,38 1,28 122 109 129 [24]

CH3-NH2 1,47 - - - - [25]

(сн3)2с=о — 1 ,21 - — [26]

многочисленных кристаллографических исследований производных аминокислот и пептидов [18], а также белков [27] приводят к средним значениям длин связей и валентных углов амидной группы, показанных на рис. 1.

Рис.1. Длина связей и валентные углы в транс- (а) и цис- (б) пептидной группе [18]

Следует отметить, что эти параметры варьируют в зависимости от конформа-ции аминокислотного остатка [28]. Так, длина C'-N-связи может изменяться от

о

1,343 до 1,371 А. Таким образом, в конденсированном состоянии амидов их геометрия согласуется с изложенными выше представлениями, однако для описания амидной группы в отсутствие межмолекулярных взаимодействий эти представления нуждаются в уточнении.

Соблюдается ли второе следствие из представлений об амидной связи как резонансном гибриде нейтральной и ионной форм, т.е. является ли амидная связь плоской?

Исследования микроволновых спектров формамида привели в 1960 г. [20] к заключению, что в этом соединении атом азота заметно выведен из плоскости, образуемой атомами С',Н1 и Н2:

ф: .

О (1)

14 Глава первая. Субстраты

двугранные углы HCNH^ и OCNH^ ^ составляют соответственно 12±5° и 7±Б°. Эти данные, однако, не согласуются с данными других исследователей [21,293.

Проблема отклонения структуры амидной группы от плоской была исследована теоретически и экспериментально в большом числе работ [16,17,19,28,30-42] Результатом этих исследований явилось обнаружение того факта, что во многих циклических [17,30,34,43] и линейных [32,33,35,40] амидах и пептидах наблюдается заметное отклонение от плоской структуры - атомы N и С могут выходить из плоскости соответственно C^ON- и С'С%—атомов (табл.2). Анализ рентгеноструктурных данных, полученных с высоким разрешением, также показывает наличие ряда неплоских амидных связей в некоторых белках [27,44]. Наи-

Таблица 2. Отклонения от плоской структуры амидной группы

Соединение ДЫ, град. еы,град. 6с,град. Литературный источник

Glu-Leu -11,4 +24,1 +0,2 [33]

Gly-Gly +3,6 +8,2 +3,3 [33]

Gly-Ala(HCl) -10,7 +T7.2 +4,5 [33]

Ala-Ala +0,8 -21 ,1 -2,7 [33]

Ac-D-Ala-D-Ala -12,0 +19,0 +3,0 [39]

AcPhe-Tyr -17,7 +11,4 +6,2 [35]

большим искажениям подвергаются связи у атома азота (угол 6Н) и в меньшей степени - карбонильного атома углерода (угол 6С,). Пирамидализация атома азота в амидах приводит к возможности двух устойчивых состояний, т.е. к возможности инверсии конфигурации:

Барьер такой инверсии составляет в формамиде около 1,1 ккал/моль [20]. Аналогично пирамидализация карбонильного углерода может приводить к двум конформациям: сик- (6N"6C,<0) и аюш- (8N'8C,>0) [40]:

Направление и величина пирамидализации зависят от электронных свойств соседней о-связи [40]. Существует линейная корреляция (R=0,893) между длинами С- N- связи и степенью пирамидализации атома азота (6N) [42].

Теоретические расчеты энергетики внеплоскостной деформации амидной группы [16,34,35,38] показывают, что минимальные значения энергии лежат в области дш=10° и 6,^-20° (рис. 2,а). Отклонения от плоской амидной связи до

1.2 Амидная группа

15

uh, ккал/моль

Рис.2. Внеплоскостная деформация амидной группы

а - изоэнергетические контуры внешюскостной деформации амидной группы в ацетамиде в зависимости от величины углов eN и Дш (Дш = 180 -ш) [рассчитано

методом IND0]; б - изменение энергии при синхронной гибридизации С- и N-атомов (рассчитано методом CND0/2, программа GE0M0)

величин дш«20о требуют энергетических затрат, не превышающих 2-3 ккал/моль [35].

Из рис 2,6 видно, что внеплоскостная деформация С'-атома, соответствую-

о

щая выходу этого атома из плоскости С -, N- и 0-атомов на 0,1 А, требует затраты энергии около 5 ккал/моль. Однако дальнейшая деформация связана со значительными энергетическими потерями.

Итак, амидная группа может заметно отличаться от плоской за счет изменений двугранного угла (ы) и выхода из плоскости атомов С и N, т.е. изменения углов 6N и 6С,. Такие изменения не требуют существенных затрат энергии. По-видимому, энергетическая диаграмма амидной группы представляет собой достаточно широкую "долину" вблизи значений 6Ы и Gc,, равных нулю, и значений ш=0° и 180°, такую, что заметные отклонения от этих значений практически не изменяют энергии системы. Однако большие изменения значений ы, в частности переход от транс-формы (ш=180°) к цис-форме (со=о°), требуют значительной энергии, так как такой переход сопровождается потерей энергии резонансной стабилизации в переходном состоянии.

о с о нон

Теоретическое [14,50] и термохимическое [51] определение энергии резонанса в амидной связи дает величину около 21-23 ккал/моль. Как видно из данных, приведенных в табл.3, эта величина близка к величине изменения свободной энергии цис-трокс-перехода [50-52 3.

Вообще говоря, многочисленные данные по барьерам цис-трокс-переходов в амидах довольно противоречивы [12]. Вместе с тем для некоторых серий амидов удается связать величины свободной энергии вращения (дС) с такими параметрами замести лей, как -прически^ константы vs.;- , ивлуиинни! (О. и

16 Глава первая. Субстраты

Таблица 3. Активационные параметры UUC-тракс-перехода в некоторых амидах

Соединение AG* ккал/моль АН* ккал/моль uS* э.е. Литературный источник

H0CNH2 17,7 18,5 +2,7 [451

H0CN(CH3)2 19,5 18,5 -5,1 [46]

CH3C0N(CH3)2 17,65 10,6 -23,5 [47]

CF3C0N(CH3)2 17,7 9,3 -28,0 [47]

(CH3)3CC0N(CH3)2 10,5 13,5 +10,0 [48]

TOCN(CH„)OI_C,IL 21 ,6 19,5 -6,5 [49]

о*) и резонансные (oR) постоянные в виде уравнений линейной зависимости свободных энергий [48,53]. Наибольший вклад в изменение барьера вращения вносят стерические параметры заместителей [53]. Барьер вращения вокруг связи C-N увеличивается с увеличением полярности растворителя [54]. Квантово-химическими методами была рассчитана [55] кривая изменения энергии при цис-тракс-переходе в формамиде (рис.3). В этих расчетах учитывалась неплоская структура формамида [20] так, что изменение угла ы характеризовало переход от неплоской цис- к неплоской транс-связи. АН, ккал/моль

Рис.3. Потенциальная кривая внутреннего вращения вокруг связи C-N в формамиде, рассчитанная методом ab initio [55]

О 30 90 150 Z10 270 330 и/, град

Хотя эти расчеты не выявляют разницы в устойчивости цис- и транс-форм, экспериментальные и теоретические данные для N-метилацетамида и других пептидов показывают существенную разницу в энергиях обеих форм [36,56], составляющую 3

страница 2
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Химия протеолиза" (8.49Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
сиреневые гвоздики купить
Компания Ренессанс: винтовые лестницы фото - надежно и доступно!
стул для посетителей самба
Предлагаем приобрести в КНС Нева асус моноблок - офис в Санкт-Петербурге, ул. Рузовская, д.11

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(10.12.2016)